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双向电泳蛋白样品的制备双向电泳蛋白样品的制备一、蛋白质提取原则：、蛋白质提取原则：二、样本裂解方式：二、样本裂解方式：三、三、2D2D蛋白裂解液组成及作用：蛋白裂解液组成及作用： 1：裂解液组成及作用 2：常见裂解液四、蛋白质提取步骤：四、蛋白质提取步骤：五、蛋白质样本制备实例：五、蛋白质样本制备实例： 1：动物组织样本制备 2：植物组织样本制备六、样本制备试剂：六、样本制备试剂：双向电泳样品制备：双向电泳样品制备： 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 免费服务热线：免费服务热线：400-699-16633 3、还原剂：、还原剂： (1) 作用：断裂蛋白质中的二硫键，以利于肽链的分离。 (2) 分类: -巯基乙醇，二硫苏糖醇（DTT）,二硫赤藓糖（DTE） a: 其中DTT带有电荷，在等点聚焦时，常常会迁移到PH范围 以外，从而使某些蛋白质的二硫键重新配对，使溶解度降低而重新沉淀下来。使用浓度范围10100 mmol/L. b: 采用非离子还原剂三丁基膦TBP可以大大增加蛋白质的溶解性，并利于蛋白从第一向转移到第二向。但是TBP在水溶液中的不稳定性和不溶性，使其在第一向IEF中维持蛋白质还原状态是相对无效的。因此在IEF时建议最好使用巯基还原剂。三、双向电泳样本制备裂解液组成及作用三、双向电泳样本制备裂解液组成及作用 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 免费服务热线：免费服务热线：400-699-1663种类种类作用作用PMSF不可逆地抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶EDTA，EGTA 可逆的蛋白酶抑制剂（如亮抑蛋白酶肽，胃蛋白酶抑制剂）多肽蛋白酶抑制剂 逆的蛋白酶抑制剂（如亮抑蛋白酶肽，胃蛋白酶抑制剂）磷酸酶抑制剂抑制磷酸酶活性Benzamidine抑制丝氨酸蛋白酶。4 4、蛋白酶抑制剂的种类及作用：、蛋白酶抑制剂的种类及作用：三、双向电泳样本制备裂解液组成及作用三、双向电泳样本制备裂解液组成及作用 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 免费服务热线：免费服务热线：400-699-1663 1、 提取前准备： （1）: 提取总蛋白，亚细胞蛋白； （2）: 裂解细胞的方式选择； （3）: 裂解液的选择。 2、 加入裂解液，冰上放置一段时间。 3、 离心去沉淀，收集上清蛋白。 4、 用于二维电泳时，考虑是否有必要除去干扰物质，如核酸， 脂类，盐等。三、双向电泳样本制备简要实验步骤三、双向电泳样本制备简要实验步骤 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 免费服务热线：免费服务热线：400-699-1663五、双向电泳样本制备实例五、双向电泳样本制备实例动物样本动物样本 （1 1）将组织切细后置于研钵中，迅速加入液氮进行研磨，直至组织变成粉末，均匀而没有明显颗粒即可。 （2 2）在研钵中加入800LB（使用前加入1 PMSF），充分溶解（收集）粉末后转移至1.5mLEP管中，4，12000r/min，离心20min，收集上清液。 （3 3）超声处理，破碎核酸。每个EP管超声3次，每次58下，然后进行离心，4，12000r/min，离心20min，收集上清液。 （4 4）将上清液分装成3管，每管约250L，每管再加入1mL丙酮-20沉淀过夜。沉淀完的蛋白质于4，12000r/min，离心20min，倒去上清液后，平放于干净的纸巾上自然干燥，即可得到处理后的蛋白质团块，-80保存备用。 (5)(5)在干燥后的蛋白质团块中加入相应量的RB（具体加入量视蛋白团块大小而定），用枪头将蛋白质团块戳小后反复吹打直至蛋白质完全溶解。对于太过干燥的蛋白质团块（呈透明状），可用50L移液器调至10L刻度处，吸上一点RB封住枪头，然后反复的将蛋白质团块戳小，再用超声仪处理，直至看不到明显的蛋白质团块为止。4，12000r/min，离心20min，吸出上清液，转移至新的EP管中。 五、双向电泳样本制备实例五、双向电泳样本制备实例植物样本植物样本 （1 1）植物样本置于研钵中，迅速加入液氮进行研磨，直至组织变成粉末，均匀而没有明显颗粒即可，在研钵中加入一小勺PVPP（用于吸附植物组织破碎后释放出的酚类物质），用药勺将粉末转移至50mL离心管中。 （2 2）在50mL离心管中加入8mL提取液混匀，再加入8mLTris饱和酚，充分振荡后放置于冰上，每隔5min振荡一次，总共6次，45000r/min，离30min，此时溶液会分层，下层为水相，上层为酚相，吸出上层液体，转移到15mL离心管中。 （3 3）加入与酚相同体积的提取液，充分振荡后放置于冰上，每隔5min振荡一次，总共6次，4，5000r/min，离心30min，吸出上层酚相，转移至新的15mL离心管中。重复一次苯酚抽提。 （4 4）加入最后得到的酚的5倍体积的醋酸铵甲醇溶液对蛋白进行沉淀，充分振荡后置于冰上保温每隔5min振荡一次，总共6次，于-20沉淀过夜。 （5 5）对沉淀过夜的蛋白质4，5000r/min，离心30min，倒掉上清液，加入5mL甲醇对蛋白进行洗涤，反复吹打均匀后，4，5000r/min，离心30min。重复一次。五、双向电泳样本制备实例：五、双向电泳样本制备实例：（6 6）加入4mL丙酮对蛋白进行洗涤，反复吹打均匀后，4，5000r/min，离心30min。重复一次操作。加入3mL丙酮，吹打均匀后将蛋白质平均分到3支1.5mLEP管中，4，12000r/min，离心20min。倒去上清液后，平放于干净的纸巾上自然干燥，即可得到处理后的蛋白质团块，-80保存备用。 (7)(7)在干燥后的蛋白质团块中加入相应量的RB（具体加入量视蛋白团块大小而定），用枪头将蛋白质团块戳小后反复吹打直至蛋白质完全溶解。对于太过干燥的蛋白质团块（呈透明状），可用50L移液器调至10L刻度处，吸上一点RB封住枪头，然后反复的将蛋白质团块戳小，再用超声仪处理，直至看不到明显的蛋白质团块为止。4，12000r/min，离心20min，吸出上清液，转移至新的EP管中。 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 免费服务热线：免费服务热线：400-699-1663六、双向电泳样本制备试剂六、双向电泳样本制备试剂Alklysis buffer(LB)ReagentReagentFinal concentrationFinal concentrationTris20mMThiourea (FW 76.12)2MUrea (FW 60.06)7MCHAPs (FW 64.89)2%(W/V)Phenol extraction bufferReagentReagentFinal concentrationFinal concentrationSucrose (FM 342.30）0.7MKCl（FM 74.55）0.1MEDTA（FM 292.25）50mMTris（FM 121.14）0.5MHClTo pH7.5醋酸铵甲醇溶液醋酸铵甲醇溶液Ammonium acetate in methanolAmmonium acetate in methanol用甲醇配制0.1M的醋酸铵 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 免费服务热线：免费服务热线：400-699-1663THANKS!