实时荧光定量PCR原理课件ppt.ppt

1234522557294时间（min）温度（）PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍 TaqMan-TaqMan-水解型探针水解型探针v 55端标记有荧光报告基团端标记有荧光报告基团(Reporter, R) (Reporter, R) ，如，如FAMFAM、VICVIC等等 ，即供体。，即供体。v 33端标记有荧光淬灭基团端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q)(Quencher, Q)v 探针完整，探针完整，R R所发射的荧光能量被所发射的荧光能量被QQ基团吸收基团吸收 ，无荧光，无荧光， R R与与QQ分开，发荧光分开，发荧光 （荧光共振能量转移原理，（荧光共振能量转移原理，FRETFRET）v TaqTaq酶可水解探针酶可水解探针 工作原理工作原理在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶以引物为起点沿模板53方向延伸，合成一条新的DNA互补链。每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中检测荧光.那我们如何对起始模板进行定那我们如何对起始模板进行定量呢？量呢？ 接触过接触过PCR的同学与同事知道我们是通过的同学与同事知道我们是通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析的。我们值和标准曲线对起始模板进行定量分析的。我们现在先搞懂三个概念：现在先搞懂三个概念： 什么叫什么叫扩增曲线、荧光阈值、扩增曲线、荧光阈值、Ct值值？ 实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理1 1、扩增曲线、扩增曲线扩增曲线图：扩增曲线图： 横坐标：横坐标：扩增循环数（扩增循环数（CycleCycle）；纵坐标：纵坐标：荧光强荧光强度度 每个循环进行一次荧光信号的收集每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光基团2 2、荧光阈值、荧光阈值荧光信号阈值荧光信号阈值 （threshold threshold ）：q 荧光阈值即是阴性阳性标本的区分值。超过此荧光值的标本为阳性，低于此值为阴性的。我们把它设定在PCR扩增的指数期。q 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即我们所说的基线q 荧光阈值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准差的10倍q 手动设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照荧光的最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99q 真正的信号:荧光信号超过阈值3 3、CT值CTCT值的定义值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。4 4、CT值的重现性横轴：横轴：PCR反映循环数反映循环数纵轴：荧光信号量纵轴：荧光信号量CtCt值的特点值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；但初始模板基本一致 Ct值则极具重现性定量原理定量原理 n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量（样本） Ex：扩增效率理想的PCR反应（Ex=1）： X=X0*2n非理想的PCR反应： X=X0(1+Ex)n在扩增产物达到阈值线时: M:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以后,M是一个常数 M=X0 (1+Ex)Ct (1) 方程式(1)两边同时取对数得: lg M=lg X0(1+Ex)Ct (2)整理方程式(2)得: lg X0= lg M- Ct lg(1+Ex) (3) LgLg起始浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到起始浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值域值的循环数即的循环数即CT值就可计算出样品中所含的模板量。就可计算出样品中所含的模板量。 标准曲线标准曲线q 我们可以看到模板DNA量越多，荧光达到阈值的循环数越少，即Ct值越小。q Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线 绝对绝对定量定量