PCR的实验步骤(6页).doc

-总RNA的抽提1. 匀浆 1份样本+3份抽提剂，加样枪吹打几次，剧烈涡旋混匀至少1分钟，在15-30条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。2. 样品可在-60-70保存至少1个月。3. 分离 15份抽提剂+4份氯仿，用力摇晃试管15秒，在30条件下孵育2-15分钟，2-8下以不超过12000*g的离心力高速冷冻离心15分钟。4. 沉淀 将水样层转移到一干净的试管中，3份抽提剂+2份异丙醇，在15 -30°C条件下孵育10分钟并在28°C下以不超过12,000×g的离心力高速冷冻离心10分钟。5. 漂洗 移去上层悬液。3份抽提剂+至少4份75%乙醇。溶于75%的乙醇在28°C至少可以保存一周，在520°C下至少可保存一年。旋涡振荡混合样品并在28°C下以不超过7,500×g的离心力高速冷冻离心5分钟。6. 再溶解 空气干燥或真空干燥510分钟，分几次移取无RNA酶的水来溶解RNA，并在5560°C下孵育10分钟。RNA完整性检测1. 电泳缓冲液 Tris 242g+乙酸 57.1ml+0.5M EDTA200mldH2O 补足至1000ml （贮存液），使用时按1：49的比例稀释成工作液。2. 制胶 (大胶用70ml,小胶用50ml):称取0.7 g(0.5 g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入70 ml(50ml)1×TAE,瓶口倒扣小烧杯.微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,将冷却至65左右的琼脂糖凝胶液加入溴化乙锭，充分摇匀（即成1.0%琼脂糖凝胶液）。3. 制板 取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干；放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并在距离底板0.51.0mm的位置上放置梳子；将冷却到65左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上（凝胶的厚度在35mm之间）,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层；室温下静置（30min左右）直至凝胶完全凝固,当胶正凝固时，准备RNA样品并取适量（如5l）加1l加样缓冲液混合，加样液中包含染料溴酚蓝BPB；垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中，加样孔一侧靠近阴极（黑末端），注入适量的TAE缓冲液，通常缓冲液高于胶面1cm。4. 加样 加RNA样品及时进行电泳使吸管与加样孔垂直（使吸管尖端刚好在加样孔开口之下）缓慢将RNA样品加入加样孔中。5. 电泳 加样完毕后，正确连接电泳槽和电源（黑的连阴极、红的连阳极），在打开电源之前设定好电压和时间，电压100mV, 时间30min。负极附近的铂丝会有气泡产生。6. 凝胶摄影7. 测纯度和浓度反转录1. 去除基因组DNA反应 于冰上配制反应混合液2(2ul）+1(1ul)+6(?ul)+RNA(不超过1ug)，应先按反应数+2的量配制Master Mix，然后再分装到每个反应管中，最后加入RNA样品。42 2 min（或者室温5 min*2），放于4。2. 反转录反应 在冰上进行，先按反应数+2的量配制Master Mix3（1ul）+5(1ul)+4(4ul)+6(4ul)，然后再分装10 l 到每个反应管中，轻柔混匀后立即进行反转录反应。37 15 min, 85 5 sec,放于4。qRT-PCR1. 反应液配制在冰上进行，配置的预混液体积要至少多于所有反应用总体积的10%。2. 按照不同仪器的操作进行。琼脂糖凝胶浓度线形DNA的最佳分辨范围0.5%1,00030,0000.7%80012,000 1.0%50010,000 1.2%4007,0001.5%2003,0002.0%502,000第 6 页-