生物药剂学与药物动力学实验讲解.docx

生物药剂学及药物动力学试验讲义中药药剂学教研室编写2006年12月目 录试验一 片剂溶出度试验 4试验二 尿药法测定水杨酸钠片剂的生物利用度 7试验三 扑热息痛血管外给药的药物动力学探讨 10试验四 大鼠在体小肠汲取试验 13试验五 氨茶碱药物动力学的探讨 15生物药剂学及药物动力学试验须知生物药剂学及药物动力学属于药物临床应用学科的范畴，具有综合性强、应用性强、创新性强等特点。生物药剂学及药物动力学试验是教学的重要组成局部，是理论及理论结合的主要方式之一。通过试验课不仅能印证、稳固和扩展教学内容，还能训练根本操作技能，培育良好的试验作风。为保证明验课顺当进展，并到达预期的目的，试验中必需做到以下六个方面：1预习试验内容 通过预习，明确试验目的及要求，对试验内容做到心中有数，并能合理支配试验依次刚好间。要明确每个处方中药物及辅料的用处。2遵守试验纪律 不迟到，不早退，不旷课，保持试验安静，未经答应，不得将试验室物品带离试验室。3重视药剂卫生 进入试验室必需穿整齐的白工作服。先将工作台面擦洗干净再开场做试验。试验过程中应始终留意台面、地面的整齐，各种废弃物应投入指定位置，不能顺手乱丢，更不能弃入水槽内。完成试验后，应将容器、仪器清洁，摆放整齐，台面擦净，经老师同意前方能分开。值日生负责整理公用器材，清扫试验室，关好水、电、门、窗。4. 细心操作、勤于思索 称量药品、试剂时，要在称量前（拿取时）、称量时和称量后（放回时）进展三次核对。称量完毕应马上盖好瓶塞，放回原处。对剧毒药品更要细致核对名称及剂量，并准确称取。试验中要严格限制好试验条件，细致操作每一道工序，以保证成品质量。试验成品应标明名称、规格、配制者、配制时间，并交老师验收。试验中遇到问题应先独立思索，再请教别人。在试验中逐步形成整齐、细致、严谨、冷静、擅长视察、擅长思索、勤于动手的试验风格。5正确运用仪器、留意平安 运用仪器时要按运用方法正确操作，不熟识操作方法时，应在老师指导下运用。各种仪器、容器运用时要留意轻拿、轻放，用毕要清洁后放回规定位置。6. 写好试验报告 试验报告是考察学生分析总结试验资料实力和写作实力的重要方面，亦是评定试验成果的重要根据。试验报告的格式如下所示：【试验目的及原理】写出试验目的及原理。【试验操作】写出详细试验步骤和试验条件。【试验结果】记录各采样时间点及采样的状态，按要求对数据进展处理，并将全班数据进展综合，求其平均值和标准差。【探讨】阐述试验原理、试验收获及教训、建议等。【思索题】答复试验思索题。每一试验内容逐一按以上依次书写试验报告。试验一 片剂溶出度试验一、试验目的1. 驾驭片剂溶出度测定方法及数据处理方法；2. 理解溶出度测定的重要意义及其应用。二、试验提示片剂溶出度是指片剂主药在体外帮助适当装置于相宜介质中溶出的速度和程度。测定溶出度的根据是的扩散理论，近年生物药剂学的探讨说明，难溶性药物的片剂，崩解时限不能作为推断难溶性药物片剂汲取的指示，因为片剂崩解后的粉粒还不能干脆被机体所汲取，溶解是汲取的主要过程，溶解度小于0.11的药物，其体内汲取常受其溶出速度的影响。溶出速度除及药物的晶型、粒经大小有关外，还及制剂的消费工艺、辅料、储存条件等有关。所以为了限制这些片剂的质量，需测定血药浓度或尿药浓度，对于一些体外溶出度及体内血药浓度有相关性的药物，则可测定其主药成分的体外溶出度作为限制该片剂质量的一项指标。本试验以对乙酰氨基酚片为样品，测定对乙酰氨基酚的溶出度。原理：对乙酰氨基酚在溶出介质中，在257 波特长有最大汲取，因此可用紫外分光光度法进展测定，测定其在257的汲取度（A），用标准曲线方程计算其对应浓度。三、试验内容1. 测出比拟法的A值， 用表示，作比照品。 取样品10片，精细称定，计算平均片重W，将称定的片子研细，再精细称取相当于W的量，加约600溶出介质（稀盐酸24加水至1000），水浴（4050）中搅伴溶解，冷至室温，移入1000容量瓶中，参加介质至足量，摇匀，过滤，精细汲取滤液1置50容量瓶中，参加0.04氢氧化钠溶液稀释至50，摇匀，照分光光度法（中国药典2005年版二部附录），在257的波特长测定汲取度A值，用表示。2. 对乙酰氨基酚片溶出度的测定 A仪器打算 转篮是用40目不锈钢制成的圆筒，高3.66，直径2.5，顶部通过金属棒连接于变速小马达上。转篮悬吊于盛有溶媒的容器中，距溶出杯底2.5，运用前安装就绪，开动电机空转，检查电路是否畅通，有无异样噪音，转篮的转动是否平稳，加热恒温装置及变速装置是否正常，如一切符合要求，就可以开场测定样品。 B. 测定方法 取溶出介质（稀盐酸24加水至1000）1000，加热至37，置溶出杯中，调整转篮转速为100转分，将精细称定重量的药片一片（W）放在转篮内，以溶出介质接触药片时为零时刻开场计时，然后按2、5、10、15、20、30分钟定时取样，取样位置固定在转篮上端液面中间、间隔 杯壁1处，每次取样5，将样品液过滤，汲取滤液1，余按试验内容1，测出比拟法A值项下，自“置50容量瓶”始，依法测定规定时间药片溶出的A值，以 表示。注：（1） 对所用的溶出度测定仪，应预先检查其是否运转正常，并检查温度的限制，转速等是否准确、升降转篮是否敏捷等。（2） 溶出方法分转篮法、桨法和小杯法三种。本试验选用转篮法，转篮的尺寸和构造应符合药典规定。（3）每次取出样品液后，应同时补充一样体积的空白溶液。（4） 根据药典规定，应同时测定6片的溶出度，鉴于试验时间限制，每试验组仅要求完成1片的测试。四、测定结果及数据处理1. 每片测定结果记录.123456取样时间（）2510152030累计溶出5溶出度的计算累计溶出 ?2. 用一般坐标纸作图求t50 以累计溶出百分比对溶出时间逐一描点,用图估法拟合-平滑曲线,过累计溶出百分比50%处引一及t轴平行的直线,及溶出曲线相交于A,过A点向t轴引垂线交于t1，此t1即为t50，此值供方差分析用。3. 用威布尔分布概率求t50，和m三个参数 从上面所作溶出曲线所见，累计溶出百分比对相应时间各数据在一般直角坐标纸上作图，并不成直线关系，但可将累计溶出百分比刚好间的关系看作统计学上的概率分布函数，用威布尔概率纸使之直线化，从图上即可极为便利的找到t50（溶解50所需时间），（溶解63.2所需时间）及m（斜率）三个参数，在威布尔概率纸作图的根本步骤如下：A. 以F(t)尺代替累计溶出百分比尺为释放时间,用原数据描点,若各点根本上呈直线分布，则可干脆拟合一条直线，尤其留意照看F(t)在30至70范围内的点，使之优先贴近该直线。B. 若各点排布呈曲线状，则沿曲线趋势延长，及t尺交点的数值作为的初步估计值，以F(t)对t-再作图，若所得各点的排列接近直线，则拟合成直线，若F(t)对作图仍为一曲线，则可用类似的方法反复修改，直至作得始终线为止。C. 在F(t)对t（或F(t)对）所作图上拟合始终线，有X1和Y轴的交点（称m点）作该直线的平行线，该平行线和Y轴交点在Y尺上投影点的读数即为m值（取肯定值）。D. 所拟合的直线及X轴的交点在t尺上投影点的读数即为m的估计数，本试验中称为值（溶出63.2所需时间）；及溶出50的交点在t尺上的投影点的读数即为t50。E. 用威布尔概率纸求出t50，和m三个参数后，可利用方差分析，相关及回来分析的数理统计法来评定同类产品不同批号或不同厂家的片剂质量；另外，还可以评定同一产品体内、体外的相关程度。4. 用溶出参数作方差分析 将两个批号共八片，按本试验方法测得的累计溶出百分比共八组数据，经威布尔概率纸作图得八条直线，由图中求出t50，和m值，将所得参数列表如下，供方差分析用。参数方差来源自由度离差平方和方差F值显著性t50组间组内合计组间组内合计m组间组内合计思索题：检查固体制剂的溶出度有何意义？哪些种类的制剂需检查溶出度？试验二 尿药法测定水杨酸钠片剂的生物利用度一、试验目的1. 通过试验驾驭用尿药速率法求算体内药动学参数；2. 通过试验驾驭药物的生物利用度的一般探讨方法；3. 通过测定求出水杨酸钠的生物半衰期。二、试验原理 药物在体内的汲取、分布、代谢和排泄等过程既有区分，又有联络，具有肯定相关性。药物在体内的速度过程改变规律及生物利用度等相关参数的提取，要通过试验采纳血药浓度法、尿药浓度法或唾液药物浓度法等方法获得。 在多数状况下，尿药浓度高于血药浓度，定量分析精细度好，测定方法较易建立，且取样便利，可免除受试者屡次抽血的苦痛。因此，在体内药物大局部以原型从尿中排出的条件下，通常可用尿药法提取消退速度常数、生物半衰期等动力学参数。 生物利用度反响药物在体内被汲取的速度和程度，它可分为相对生物利用度及肯定生物利用度。当药物的口服制剂及静脉注射剂相比拟，可求算肯定生物利用度；及其他制剂相比拟，可求算相对生物利用度。本试验采纳口服真溶液剂为参比，测定水杨酸钠片剂的相对生物利用度。三、试验方法 1. 绘制水杨酸钠标准曲线 精细称取枯燥恒重的水杨酸钠0.5g，置100容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，各精细汲取此溶液1.5、2.5、3.5、4.5、5.5分别置50容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，得浓度分别为0.15、0.25、0.35、0.45、0.55的标准溶液。取枯燥干净的带塞玻璃试管5支，分别精细汲取以上各溶液的水杨酸钠标准溶液1于试管中，再分别参加(3)3试管5，混合匀称，用72-100型分光光度计于540波特长测定汲取度，将测得数据进展回来分析，得汲取度对标准溶液浓度的回来方程，即为标准直线。参比液以蒸馏水1代替标准液。2. 测定生物利用度A. 试验方法I. 选择受试者的条件II. 对受试者的要求a) 服药前48小时开场,不吃任何含水杨酸盐类食物。b) 小便应按规定搜集完全，不得损失，并保持尿样不污染。在搜集尿样期间内不作猛烈运动。c) 早晨搜集空白尿，空腹时口服水杨酸钠片0.6g，比照组口服相当于0.6g的水杨酸钠真溶液。d) 按以下时间喝水和搜集尿样，并记录排尿量：服药当天：7：30 喝水 1507：55 小便（收空白尿）8：00 用250温开水吞服0.3g片的水杨酸钠片两片8：30 搜集尿样9：00 搜集尿样10：00 搜集尿样 喝水20012：00 搜集尿样 喝水15014：00 搜集尿样 喝水10016：00搜集尿样 喝水10018：00搜集尿样 20：00搜集尿样 喝水10022：00搜集尿样 第二天8：00搜集尿样 22：00搜集尿样 每次搜集尿样的时间必需小便一次，在上一次搜集尿样后所排出的小便，均要搜集完全，作为下一个时间尿样，每次收尿容器必需洗净，用蒸馏水清洗，沥干备用。受试者服用样品的支配本试验仅作两种剂型，同一受试者二次服药之间应间隔4天以上。测定方法每次尿样测量体积后，精细汲取1于枯燥干净的试管中，加(3)3试管5，按“绘制标准曲线”项下进展测定，参比液用空白尿1替代含药尿样，如显色时发觉色泽太深，则根据状况将尿样稀释后取样测定（假如气候燥热，须将空白尿及尿样置冰箱中保存，以防长霉发酵，影响结果的准确性。）B. 数据处理I. 将所测各时间尿样的汲取度代入标准直线，计算出该尿样浓度（）再乘以尿量（如尿样稀释则需乘上稀释倍数），计算出各时间的尿药排泄量。II. 以t对相邻两时间的中点时间（t中）作尿药排泄速度曲线。x : 各时间的尿药排泄量. t: 相邻两次集尿时间的间隔时间.作图:. 根据作出的尿药排泄曲线求出水杨酸钠片剂和真溶液的动力学参数. 斜率(b)=(Y21)/( X21) 或将曲线后部直线局部进展回来分析,求出直线斜率b 消退速度常数: 2.303×b 生物半衰期: t1/2=0.693剂型消退速度常数k半衰期(小时)总排泄量()片剂真溶液. 生物利用度：以真溶液为参比，求片剂的相对生物利用度 生物利用度（）？V. 尿药法数据记录姓名： 性别： 产品厂家及批号：药量： 服药时间：序号集尿时间（小时）口服水杨酸钠真溶液口服水杨酸钠片尿量（ ）稀释倍数汲取度平均浓度（）排泄量（）尿量（）稀释倍数汲取度平均浓度（）排泄量（）1020.53142546678810912101411241238累计累计序号集尿时间（h）中点时间（t中）间隔时间（t）真溶液片剂排泄量(X)平均尿药速度（Xt）(X/t)排泄量(X)平均尿药速度（Xt）(X/t)010.50.250.5210.750.5321.51443256526872710928121129141321024191011383114思索题：血药浓度法及尿药法测定药物动力学参数各有何特点？试验三 扑热息痛血管外给药的药物动力学探讨一、试验目的1.通过本试验，驾驭生物样品分析方法的根本要求。2.驾驭扑热息痛的血药浓度测定方法及有关参数的计算。二、试验原理 扑热息痛及亚硝酸发生亲电取代反响，生成2-亚硝基4乙酰氨基苯酚，用氨基磺酸铵除去过量的亚硝酸，在碱性条件下，2-亚硝基4乙酰氨基苯酚于430波特长有最大汲取。三、试验内容1. 标准曲线精细称取扑热息痛100，以95乙醇3溶解加适量水，转移于100容量瓶中，加水至刻度，充分摇匀，得扑热息痛储藏液（1）,精细汲取储藏液2.5准确稀释至10，得250的标准液。分别精细汲取250的标准液0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8于离心管中，分别加水使成2，各加家兔血浆1.5，摇匀，再参加210三氯醋酸，充分混合再离心20分钟（3000）。汲取上清液4于25带塞刻度试管中，参加16N盐酸，120 2溶液，摇匀，放置5分钟，使反响完全。渐渐参加215氨基磺酸，振摇至无气泡产生，流水冷却，参加2.520 摇匀，用2比色杯于430波特长测定汲取度。用蒸馏水2代替标准液同法处理，作空白比照。求出回来方程标准液（）0.30.60.91.21.51.8浓度（）50100150200250300A（3次）A标准曲线（回来方程）2. 回收率试验分别精细汲取250的标准液0.3、0.9、1.8于离心管中各三份，分别加水使成2，各加家兔血浆1.5，摇匀，以下操作同标准曲线项下“参加210三氯醋酸，充分混合“起，依法操作，测定吸光度，代入回来方程求其浓度，并及参加时浓度相比求出回收率。初始浓度（）吸光度测得浓度（）回收率(%)回收率均值(%)21.4364.29128.583. 精细度试验精细汲取250的标准液0.3、0.9、1.8于离心管中各6份，分别加水使成2，各加家兔血浆1.5，摇匀，以下操作同标准曲线项下“参加210三氯醋酸，充分混合“起，依法操作，测定吸光度，求其日内精细度。初始浓度（）吸光度吸光度均值(%)21.4364.29128.584.样品稳定性考察将上述标准曲线项下的“0.9”样品处理好后于0.5h、1h、2h、3h、4h测定汲取度，考察处理后样品室温放置时的稳定性。时间（h）00.51234吸光度均值(%)5. 样品测定 取家兔5只（雌兔不得怀孕），每只体重2.5 3 ，给药前先从耳静脉取血3留作比照。然后按200的剂量，肌注给药（给药前禁食12小时）。给药后按第3、5、10、15、25、30、40、60、100、140、180分钟，定时从兔耳静脉取血3 ，用枯燥并带有适量肝素钠的离心管集血，轻轻摇匀，离心10分钟（3000），汲取血浆于枯燥试管中，置冰箱中保存备用。取出无药血浆及各时刻的含药血浆，室温解冻后进展测定：汲取1.5血浆，置刻度离心管中，加水2，混匀，以下操作同标准曲线项下“参加210三氯醋酸，充分混合“起，依法测定汲取度，代入标准曲线，计算出该时刻的血药浓度，以无药血浆按同法处理作比照。6. 结果记录兔子体重： 给药剂量：测定记录：编号1234567891011T()35101525304060100140180AAC()T()C()尾段直线相外推线浓度的对数（外推）外推线浓度（C外推）残数浓度（）C残C外推残数浓度的对数残尾段直线相斜率 K残数斜率 四、数据处理1. 以血药浓度（）为纵坐标，时间为横坐标，作汲取曲线图（血药浓度时间曲线）。2. 以血药浓度（）的对数对时间作血药浓度时间的半对数图，从图中求出消退速度常数K，再用残数法求出汲取速度常数。3. 提取参数（t1/2汲取、t1/2消退、）A. 汲取半衰期: t1/2汲取=0.693B. 消退半衰期: t1/2消退=0.693 C. 血药浓度-时间曲线下的总面积(0-)D. 达峰时间() 根据及K求出达峰时间 ( )/()=2.303×()/()抛物线拟合法用抛物线2的峰段代替药时曲线的峰段，选取试验数据中最大浓度C（I）左右三点，1, C(1), , , 1, C(1)代入，则有：C(1)·1·t21··t2iC(1)= ·1·t21解上述方程组，求得P、Q、R的值抛物线的峰丢按横坐标（峰时）为2RE. 峰浓度截距(可以从图中求得)试验结果:思索题：血药浓度法求算药物动力学参数的原理？血药浓度法测定药物动力学参数的要求？试验四 大鼠在体小肠汲取试验一、试验目的1.驾驭大鼠在体小肠汲取的试验方法。2.驾驭计算药物的汲取速度常数（），以及每小时汲取率的计算方法。二、试验原理大多数药物以被动扩散方式从生物膜的高浓度侧通过膜向低浓度侧转运。被动扩散可用第肯定律来描绘。该定律指出，扩散速度（）正比于膜两侧的浓度差（C）,因此有：（1）式中C是消化道中的药物浓度，是血液中药物浓度，是汲取速度常数，其值大小取决于药物的扩散常数、汲取膜的厚度及面积以及药物对膜的穿透性。胃肠道汲取的生物学过程包括这样一个系统，即药物从胃肠道屏障的一侧向另一侧扩散。因为进入血液的药物很快分布到全身，故及汲取部位比拟，血中药物浓度维持在很低的程度。几乎在全部口服给药的状况下，对于胃肠道来说，血液的作用如同“水槽”。并且在整个汲取相保持很大的浓度梯度，C>>，则CC，于是（1）式可以简化为：（2）此为一级速度方程式的标准形式。胃肠道按一级动力学从消化液中汲取大多数药物。用消化液中药物量的改变）)表示汲取速度，则： (3)将（3）式积分，并在方程两侧同取对数。（4）式中为消化液中药物量，(0)为零时刻消化液中药物量，为药物汲取速度常数。以对t作图得一条直线，其斜率为药物在小肠中的汲取速度常数（）。三、试验内容1. 试验操作（1） 取85供试液（100试液含2, 酚红2）参加循环装置中。（2） 将试验前禁食一夜，体重200g左右的雄性大鼠，称重，腹腔注射戊巴比妥钠（剂量为100g体重注射0.4），麻醉后并加以固定。（3） 沿腹中线翻开腹腔。自十二指肠上部及回肠下部各剪开一个小口，各插入直径为0.5的玻璃管，用线扎紧，并用37的生理盐水将小肠内容物冲洗干净，然后将大鼠串联到循环装置中。（4） 开动蠕动泵，以5分的流速循环10分钟后流速调至2.5分。（5） 自烧瓶中取样1.5（1、0.5各一份）为和酚红零时间样品，并补加2酚红溶液（每毫升试液含酚红20g），其后每15分钟取样（1、0.5各一份），同时补加酚红溶液2。由于酚红不被小肠汲取，用以测定水被小肠汲取的量。2. 定量方法（1）磺胺嘧啶的定量取样品1，参加1 5,参加0.12 1, 摇匀，放置3分钟，参加0.5氨基磺酸氨1，摇匀，放置3分钟。参加0.1萘乙二胺2，摇匀，放置20分钟。在波长555处测定汲取度。参比溶液的配制：取1供试液按磺胺嘧啶的定量方法不加萘乙二胺显色剂。（2） 酚红定量取酚红溶液0.5，参加0.2 5，摇匀，在波长555处测定汲取度。参比溶液：0.2 溶液。3标准曲线的制备（1）酚红的标准曲线精细称取酚红100，置1000容量瓶内，加123溶液溶解并稀释至刻度，制成100的储藏液。取1，2，3，4，5，6的储藏液于10容量瓶中，加蒸馏水至刻度。自上述各溶液中汲取0.5，按酚红的定量方法测定汲取度，并绘制标准曲线。（2）磺胺嘧啶标准曲线精细称取磺胺嘧啶标准品10置100容量瓶中，以蒸馏水溶解并稀释至刻度，使成100的储藏液。取储藏液适量，稀释成20100的溶液，分别汲取2，4，6，8，10于10容量瓶中，加蒸馏水至刻度。从上述溶液中汲取1按磺胺嘧啶定量方法测定汲取度，并绘制标准曲线。四、数据处理1 将试验数据按表1中公式进展计算。表1大鼠在体小肠汲取量的计算式取样时间（h）汲取度浓度酚红汲取度酚红浓度供试液体积剩余药量循环前A0C0A0C0V0=85P0=85C00A1C1A1C10.25A2C2A2C20.5A3C3A3C3.AnCn2. 以剩余药量的对数对时间作图，求出汲取速度常数和每小时汲取率（）。每小时汲取率（）（零时间剩余药量60分钟剩余药量）/零时间剩余药量100思索题：用小肠剩余药量测定汲取速率常数的原理？试验五 氨茶碱药物动力学的探讨一、试验目的1.驾驭紫外分光光度法测定氨茶碱的血药浓度，求算有关药动学参数二、试验原理由于氨茶碱有效血药浓度范围较窄，一般为1020，故有必要进展临床监测。在酸性条件下，血清中的茶碱可用有机溶媒萃取出，并同时沉淀血清蛋白，再用碱夜把茶碱自有机溶媒中萃取出，然后进展紫外测定，采纳双波长测定法，分别测定在波长274和298处的汲取度。三、试验内容1. 氨茶碱标准曲线的绘制：取氨茶碱标准品，精细称量以0.1 溶液配成500的贮备液。另取试管5只，各参加0.5空白血清，然后依次参加上述贮备液4.0l、8.0l、12l、16l、20l，各参加0.1 溶液至4.0，其浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5的标准液。按血药浓度测定法处理，用紫外分光光度计在波长274及波长298处测定汲取度（0.1 溶液作参比）。2. 血药浓度的测定：取血清样品0.5置试管中，加0.1盐酸溶液0.2，5异丙醇氯仿液5，振摇混合，离心（2500）10。汲取氯仿液（上层）4.0置于另一试管中，参加0.1 溶液4.0，混匀，离心10，汲取碱液（上层）33.5，用紫外分光光度计，测定碱液在波长274和波长298处的汲取度。3. 药动学试验设计：选用雄性家兔称重，按10剂量给药，以5葡萄糖溶液稀释氨茶碱注射剂10倍，由耳静脉给药（2内注完）。然后分别于0.25h、0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h取血约2（另一耳静脉取血）。分别血清（试管不涂肝素，静置，离心2000），备用。依法测定血药浓度。四、试验结果1.绘制标注曲线根据测定的汲取度计算A，即AA274298。列表，求出标准曲线回来方程。表1氨茶碱标准曲线数据试管号12345C()A274A298A回来方程2. 将测定的血药浓度测定数据填于表2，根据标准曲线计算样品的血药浓度。表2血清样品中氨茶碱浓度0.250.51.01.523468T(h)A274A298AC()3. 将表2中数据以半对数作图，得到血药浓度时间图。按二室模型处理方法，求出、A、B等参数。思索题：做好本次试验的关键是什么？在操作中应留意哪些问题？