微生物室细菌菌落总数测定操作规程(3页).doc

-微生物室细菌菌落总数测定操作规程-第 3 页微生物室菌落总数测定操作规程菌落总数：将一定量的待测样在营养琼脂上，有氧条件下37培养48h后，营养琼脂中所含菌落的总数1 材料准备1.1 培养基与试剂1.2 营养琼脂培养基1.2.1.1 成分a蛋白胨 10gb牛肉膏 3gc氯化钠 5gd琼脂 1020ge蒸馏水 1000mlf生理盐水 约1000ml.2 制法将上述成分混合并加热溶解后，加入琼脂加热溶化，然后补足所需要的水分，再7.6，然后放入三角瓶中包扎好后，在121条件下灭菌20min，冷却备用。1.3 仪器a 高压蒸汽灭菌器（锅）b 恒温培养箱（37±1）c 电炉d 天平e 冰箱f 放大镜g pH计（或精密pH试纸）h 灭菌试管、平皿（=9cm）、刻度吸管、管塞等i 灭菌移液枪枪头j 玻璃菌落涂布器2 检验步骤2.1 取样并稀释2.1.1 制备无菌生理盐水制取1000ml生理盐水，在121条件下灭菌20min冷却至室温，放置于无菌条件下备用。 取样稀释用灭菌注射器（或灭菌吸管）吸取一定量的待测样品注入已盛有一定量灭菌生理盐水和足够的玻璃珠的灭菌三角瓶中，扎好瓶口，在震荡器中振摇20min，制成10-1的菌悬液，再用无菌吸管（或移液枪）在10-1的菌悬液取1ml，加入另一个已盛有9ml无菌生理盐水的试管中，混匀，制成10-2的菌悬液。按此法依次制成10-3,10-4,10-5,10-6,10-7等不同稀释度的菌悬液备用。2.2.1 制平板并涂布将灭菌后的培养皿取出，冷却。将每个培养皿里倾注约15-35ml已溶融化并冷却到45左右的培养琼脂，待其完全凝固后选择34个合适的稀释度的菌悬液，移取0.1ml于培养基上，用灭菌的涂布器将菌悬液均匀的涂布于培养基表面，将培养皿放置于水平桌面上至少20min，使微生物完全吸附于培养基上。每次检验时应做一平行接种，同时另用一个平皿只倾注营养琼脂培养基作空白对照(视情况可不做空白对照)。2.2.2 培养翻转平皿，使底面朝上，置于恒温培养箱内于36倒置培养48h。3 菌落计数及报告3.1 计数在培养完成后，应立即取出平皿，对每个平皿上的菌落进行计数。计数可用眼睛直接观察，必要时也可用放大镜检查，以防遗漏。在记下个平皿的菌落数后，应求出同稀释度的平均菌落数，供下一步计算时应用。计数时要注意的问题：1）在求同稀释度的平均数时，若其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则该皿不宜采用，应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的平均菌落数。2）如果片状菌落不到平皿的一半，而另一半中的菌落数分布又很均匀，则可将此半皿计数后乘以2来代表全皿菌落数，然后再求该稀释度的平均菌落数。 不同稀释度的选择及报告应首选平均菌落数在30300之间者进行计算，如果只有一个稀释度符合此要求，则将将该菌落数乘以稀释倍数来报告。1）若两个稀释度均符合要求，则视其菌落数的比值来定，如比值2则报告两者的平均数，若比值2则报告稀释度较小的。2)若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则以稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告；若都大于300，则以稀释度最高的乘以稀释倍数报告。3)若所有稀释度的平均菌落数均不在30300之间，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告；若所有平板上均无菌落生长，则以未检出报告。4）若所有平板上都菌落密布，则应在稀释度最大的平板上，任意数其中两个平板1cm2中的菌落数，除2求出每平方厘米内的平均菌落数，再乘以皿底面积63.6，再乘其稀释倍数做报告。5）若菌落数在100以内时按实有数报告，大于100时采用两位有效数字，有效数字后的采用四舍五入。注：1、以上从到2.2.2的操作均需在无菌操作台上完成，且无菌操作台应处于正常的工作状态。 2、以上各稀释度的试管以及平皿等，每个均应有标签标识。