动物细胞基因工程课件 高中生物竞赛.pptx

动物细胞基因工程,动物基因工程概念,应用DNA重组技术，按照人的意图，在基因水平上改变生物细胞的遗传特性，或应用现代生物技术，对动物细胞基因组进行操纵或改造的科学工程。,动物细胞基因工程的基本流程,目的基因的获得 载体的选择与构建 重组DNA导入细胞 转化或转染细胞的筛选 重组 DNA 的鉴定,目的基因的获得,化学合成 基因文库 RT-PCR,载体,质粒载体,慢病毒载体,慢病毒（Lentivirus）载体是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的基因治疗载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可以在体内长期的表达。慢病毒载体(LV)在基础科学研究、细胞治疗和基因治疗中的应用越来越广泛。,慢病毒载体,构建稳定细胞株的必选载体； CAR-T细胞治疗中主要使用的病毒载体； 病毒包装周期，23周内完成； 慢病毒感染细胞多数需要聚凝胺（polybrene）辅助。 感染细胞后2-4天后呈现表达丰度。,腺病毒载体,腺病毒载体（adenovirus）是以腺病毒为原型进行基因功能改造而成的，无外壳的双链DNA病毒，病毒载体转基因效率高，体外实验通常接近100%的转导效率；可转导不同类型的人组织细胞，不受靶细胞是否为分裂细胞所限；容易制得高滴度病毒载体，在细胞培养物中重组病毒滴度可达11次方；进入细胞内并不整合到宿主细胞基因组，仅瞬间表达，安全性高。,腺病毒载体,基因瞬时表达首选载体； 高浓度浓缩，可用于动物实验； 病毒包装周期：68周； 腺病毒可以直接感染细胞无需polybrene辅助。 感染细胞后24h后呈现表达丰度。 毒种可在HEK293A细胞中反复扩增。,腺相关病毒（Adeno-associated Virus，AAV）,属细小病毒科，为无包膜的单链线状DNA病毒。只有在腺病毒或者孢疹病毒等辅助病毒协助下，宿主才能产生具有感染性的AAV，所以AAV被称为腺相关病毒。,腺相关病毒（AAV）组织噬性,AAV1：骨骼肌嗜性（包括心肌），神经组织也可以感染； AAV2：有效转导肌肉，肝脏，脑组织，视网膜; AAV5：视网膜、神经系统、关节滑膜嗜性、肺； AAV8：肝嗜性，视网膜、神经组织也可以感染； AAV9：心肌嗜性，可穿过血脑屏障； AAV-DJ：广谱性侵染各种细胞，可做细胞实验。,病毒载体的比较,病毒载体的应用,病毒载体的应用,动物细胞基因导入,外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大；病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响；所以现在对于很多普通细胞系，一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。,脂质体转化,利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。,磷酸钙沉淀法,酸钙沉淀法是基于磷酸钙-DNA复合物的一种将DNA导入真核细胞的转染方法，磷酸钙被认为有利于促进外源DNA与靶细胞表面的结合。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮作用进入靶细胞，被转染的DNA可以整合到靶细胞的染色体中从而产生有不同基因型和表型的稳定克隆。这种方法首先由Graham和vander Ebb使用，后由Wigler修改而成。可广泛用于转染许多不同类型的细胞，不但适用于短暂表达，也可生成稳定的转化产物。,Cre-loxP 技术简介,Cre-loxP 原理,Cre-loxP原理,Cre-loxP 原理,Nature Cell Biology volume 13, p513518(2011),Cre-loxP 技术应用,Cre-loxP 组织特异性应用,Cre-loxP 可诱导性应用,Cre-loxP 的优缺点,CRISPR-Cas9技术,基因编辑工具的更新,CRISPR-Cas9技术来源,CRISPR-Cas9系统组成,CRISPR-Cas9技术流程,CRISPR-Cas9技术优势,Cre-loxP与病毒工具结合,Cre-loxP与病毒工具结合,Cre-loxP与病毒工具结合,Cas9与病毒工具结合,Cas9与病毒工具结合,Cre-loxP、CRISPR-Cas9与病毒工具结合,