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免疫组织化学检验技术第一页，讲稿共六十二页哦第二十二章第二十二章 免疫组织化学检验技术免疫组织化学检验技术第二页，讲稿共六十二页哦免疫组织化学检验技术又称免疫细胞化学检验技免疫组织化学检验技术又称免疫细胞化学检验技术术 -是利用标记的特异性抗体（或抗原）与组织是利用标记的特异性抗体（或抗原）与组织细胞内抗原（或抗体）进行的抗原抗体反应和细胞内抗原（或抗体）进行的抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对组织和细胞抗原进行组织化学的呈色反应，对组织和细胞抗原进行定性、定位、定量测定的免疫检测方法。定性、定位、定量测定的免疫检测方法。第三页，讲稿共六十二页哦免疫组化的检测原理免疫组化的检测原理第四页，讲稿共六十二页哦免疫组化的检测原理免疫组化的检测原理第五页，讲稿共六十二页哦免疫组化的检测原理免疫组化的检测原理第六页，讲稿共六十二页哦第一节第一节 免疫组化检验技术基本知识免疫组化检验技术基本知识第七页，讲稿共六十二页哦免疫组化全过程免疫组化全过程第八页，讲稿共六十二页哦一、标本制作一、标本制作 标本制作是获得良好的免疫细胞组织化学分标本制作是获得良好的免疫细胞组织化学分析的保障，良好的细胞和组织学结构将有助于抗析的保障，良好的细胞和组织学结构将有助于抗原的准确显示和定位。原的准确显示和定位。（一）标本的主要来源（一）标本的主要来源 主要有：主要有：活体组织活体组织 各种体液及穿刺液各种体液及穿刺液 培养细胞等培养细胞等 第九页，讲稿共六十二页哦（二）标本的固定与保存（二）标本的固定与保存 1组织材料的固定目的组织材料的固定目的 防止组织细胞的死后变化，以保持其固有形态防止组织细胞的死后变化，以保持其固有形态 使细胞内的蛋白质等各种抗原成份转变成不溶性物使细胞内的蛋白质等各种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它原有的结构质，以保持它原有的结构 使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射率，以便染色后易于鉴别和观察折射率，以便染色后易于鉴别和观察 固定剂兼有硬化作用，使组织硬化，便于制片固定剂兼有硬化作用，使组织硬化，便于制片 防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构 经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便于辨认。晰，便于辨认。第十页，讲稿共六十二页哦 2固定剂的选择固定剂的选择 最佳固定剂的标准最佳固定剂的标准 最好地保持细胞和组织的形态结构最好地保持细胞和组织的形态结构 最大限度地保存抗原的免疫活性最大限度地保存抗原的免疫活性 3固定方法固定方法 固定方法常用固定方法常用 浸泡法浸泡法主要适用于活检和手术标本以及其主要适用于活检和手术标本以及其它不能进行灌注的组织固定。它不能进行灌注的组织固定。灌注法灌注法适用于动物实验研究。适用于动物实验研究。第十一页，讲稿共六十二页哦第十二页，讲稿共六十二页哦（三）玻片的处理（三）玻片的处理 玻片的处理是做好免疫组化染色的重要步骤之一玻片的处理是做好免疫组化染色的重要步骤之一 一般用免疫组织化学的载玻片均需涂一定的黏合一般用免疫组织化学的载玻片均需涂一定的黏合剂，常用的切片黏合剂有树脂胶、多聚赖氨酸和防剂，常用的切片黏合剂有树脂胶、多聚赖氨酸和防脱片剂脱片剂（四）切片方法的选择（四）切片方法的选择第十三页，讲稿共六十二页哦第十四页，讲稿共六十二页哦二、抗原处理二、抗原处理（一）进行抗原的暴露和修复的原因（一）进行抗原的暴露和修复的原因 1.固定液的影响固定液的影响 2.抗体制备的影响抗体制备的影响 （二）抗原的暴露（二）抗原的暴露 主要采用酶消化的方法主要采用酶消化的方法 在选择酶消化时，应针对要显示的不同的在选择酶消化时，应针对要显示的不同的抗原成分而选用不同的酶抗原成分而选用不同的酶 在日常工作中用胰蛋白酶消化即可在日常工作中用胰蛋白酶消化即可 第十五页，讲稿共六十二页哦（三）热诱导的抗原修复（三）热诱导的抗原修复 抗原修复是以高温、高压对常规固定石蜡切片抗原修复是以高温、高压对常规固定石蜡切片进行抗原修复以提高抗原抗体的阳性检出率进行抗原修复以提高抗原抗体的阳性检出率 微波处理法微波处理法水浴锅法水浴锅法压力锅法压力锅法第十六页，讲稿共六十二页哦三、抗体处理三、抗体处理抗体是免疫组织化学技术的首要试剂抗体是免疫组织化学技术的首要试剂（一）抗体的选择（一）抗体的选择 具有高度特异性和稳定性的优质抗体具有高度特异性和稳定性的优质抗体（二）抗体的稀释（二）抗体的稀释 抗原抗体反应须有适当的比例，过量或不足抗原抗体反应须有适当的比例，过量或不足均不能达到预期结果均不能达到预期结果（三）抗体的合理保存（三）抗体的合理保存 要特别注意保持抗体的生物活性要特别注意保持抗体的生物活性 第十七页，讲稿共六十二页哦四、常用标记物四、常用标记物（一）荧光素（一）荧光素 如：异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明等如：异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明等（二）酶（二）酶 如：辣根过氧化物酶如：辣根过氧化物酶(HRP)（三）生物素（三）生物素-亲和素系统亲和素系统（四）免疫金标记技术（四）免疫金标记技术（五）免疫铁蛋白技术（五）免疫铁蛋白技术第十八页，讲稿共六十二页哦五、免疫组织化学技术的结果判断五、免疫组织化学技术的结果判断（一）对照染色设计（一）对照染色设计 为了保证免疫组织化学染色的准确性，证明和肯定为了保证免疫组织化学染色的准确性，证明和肯定阳性结果的特异性，排除某些非特异性染色，通常需针阳性结果的特异性，排除某些非特异性染色，通常需针对第一抗体设立对照。对第一抗体设立对照。1.1.阳性对照阳性对照 用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫组用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫组织化学染色。织化学染色。目的是证实所用免疫组化染色流程的有效性，排除假目的是证实所用免疫组化染色流程的有效性，排除假阴性的可能。阴性的可能。2.2.阴性对照阴性对照 用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈阴性结果，称用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈阴性结果，称阴性对照。阴性对照。目的是排除假阳性。目的是排除假阳性。第十九页，讲稿共六十二页哦3.3.阴性试剂对照阴性试剂对照 是指用于证实在免疫组化染色中所用试剂（尤是指用于证实在免疫组化染色中所用试剂（尤其是特异性抗体试剂的有效性和可靠性）而设立其是特异性抗体试剂的有效性和可靠性）而设立的同步免疫染色对照，包括有：空白对照、替代的同步免疫染色对照，包括有：空白对照、替代对照、吸收试验和抑制试验等。对照、吸收试验和抑制试验等。4.4.自身对照自身对照 是指在同一标记切片上的自身组织成分的阴是指在同一标记切片上的自身组织成分的阴性背景对照。性背景对照。第二十页，讲稿共六十二页哦（二）阳性结果（二）阳性结果阳性细胞的显色可位于细胞膜、细胞质和细胞核阳性细胞的显色可位于细胞膜、细胞质和细胞核 免疫显色强度和阳性细胞密度是定性、定量指标免疫显色强度和阳性细胞密度是定性、定量指标 阳性细胞的着色形态（如胞膜型、胞核型、胞阳性细胞的着色形态（如胞膜型、胞核型、胞质质(浆浆)型等）及组织分布特点（如局灶型、弥漫型、型等）及组织分布特点（如局灶型、弥漫型、片块型等）主要是定位指标片块型等）主要是定位指标哪怕只有少数细胞阳性（只要是抗原所在部位）哪怕只有少数细胞阳性（只要是抗原所在部位）也应视为阳性表达也应视为阳性表达第二十一页，讲稿共六十二页哦（三）阴性结果（三）阴性结果 阴性结果不能简单视为抗原不表达，由于染色阴性结果不能简单视为抗原不表达，由于染色方法灵敏度有高低之分，有时可因灵敏度不够，而方法灵敏度有高低之分，有时可因灵敏度不够，而导致阴性反应。导致阴性反应。（四）特异性显色和非特异性显色的鉴别（四）特异性显色和非特异性显色的鉴别 1.1.分布位置分布位置 特异性反应必须分布于特定抗原部位特异性反应必须分布于特定抗原部位 非特异性反应无一定的分布规律非特异性反应无一定的分布规律 第二十二页，讲稿共六十二页哦2.2.显色强度显色强度 特异性反应由于细胞内抗原含量不同，显特异性反应由于细胞内抗原含量不同，显色强度不一。阳性细胞的染色常定位于细胞，色强度不一。阳性细胞的染色常定位于细胞，并与阴性细胞间有明显间隔并与阴性细胞间有明显间隔 而非特异性染色常不限于单个细胞，常为成片而非特异性染色常不限于单个细胞，常为成片的细胞的细胞 3.3.其他其他 在过大的组织块，中心固定不良也会导致在过大的组织块，中心固定不良也会导致非特异性显色非特异性显色 第二十三页，讲稿共六十二页哦第二十四页，讲稿共六十二页哦六、质量控制六、质量控制 质量控制是免疫组织化学检验技术取得满意结果质量控制是免疫组织化学检验技术取得满意结果的必要条件。的必要条件。（一）试剂质量控制（一）试剂质量控制 抗体的质量是免疫组织化学染色成功的关键抗体的质量是免疫组织化学染色成功的关键（二）操作过程质量控制（二）操作过程质量控制 实验操作实验操作 标本的质量控制标本的质量控制（三）仪器设备和器具的质量控制（三）仪器设备和器具的质量控制第二十五页，讲稿共六十二页哦第二节第二节 酶免组织化学检验技术酶免组织化学检验技术 酶免组织化学检验技术是在一定条件下，应用酶免组织化学检验技术是在一定条件下，应用酶标抗体（抗原）与组织或细胞标本中的抗原（抗酶标抗体（抗原）与组织或细胞标本中的抗原（抗体）发生反应，然后加入酶的底物，催化底物显色，体）发生反应，然后加入酶的底物，催化底物显色，借助光镜或电镜，就可识别出标本中抗原（抗体）借助光镜或电镜，就可识别出标本中抗原（抗体）的分布和性质；也可通过图像分析技术达到定量的的分布和性质；也可通过图像分析技术达到定量的目的。目的。第二十六页，讲稿共六十二页哦一、标本制作一、标本制作常用的标本有组织切片、组织印片和细胞涂片常用的标本有组织切片、组织印片和细胞涂片 酶免组织化学检验技术可分为酶免组织化学检验技术可分为 酶标记抗体免疫组织化学染色法酶标记抗体免疫组织化学染色法 非标记抗体酶免疫组织化学染色法非标记抗体酶免疫组织化学染色法第二十七页，讲稿共六十二页哦二、酶标记抗体的免疫组化染色法二、酶标记抗体的免疫组化染色法（一）原理（一）原理 酶标记抗体的免疫组织化学染色法是借助交酶标记抗体的免疫组织化学染色法是借助交联剂的共价键作用将酶直接连接在抗体（或抗抗联剂的共价键作用将酶直接连接在抗体（或抗抗体）上，酶标抗体（或抗抗体）与组织内特异抗体）上，酶标抗体（或抗抗体）与组织内特异抗原或抗原抗体复合物反应后，通过酶对底物的催原或抗原抗体复合物反应后，通过酶对底物的催化作用，生成不溶性有色产物并沉淀在特定位置，化作用，生成不溶性有色产物并沉淀在特定位置，达到对抗原定性、定位、定量检测的目的。达到对抗原定性、定位、定量检测的目的。第二十八页，讲稿共六十二页哦（二）技术类型（二）技术类型 1.1.直接法直接法 形成抗原一抗体一酶复合物形成抗原一抗体一酶复合物2.2.间接法间接法 形成形成Ag-Ab1-Ab2EAg-Ab1-Ab2E复合物复合物3.3.酶标抗体三步染色法酶标抗体三步染色法 为间接法的改良法为间接法的改良法 形成形成Ag-Ab1-Ab2E-Ab3EAg-Ab1-Ab2E-Ab3E复合物复合物（三）方法评价（三）方法评价第二十九页，讲稿共六十二页哦三、非标记抗体酶免疫组化染色法三、非标记抗体酶免疫组化染色法（一）原理（一）原理 该技术首先用酶免疫动物，制备效价高、特异该技术首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体（性强的抗酶抗体（Ab3Ab3），将酶与），将酶与Ab3Ab3结合形成复结合形成复合物，然后利用第二抗体（合物，然后利用第二抗体（Ab2Ab2）作桥，）作桥，Ab2Ab2既可既可与与 Ab3Ab3的的FcFc段结合，又可与结合在组织抗原上的段结合，又可与结合在组织抗原上的第一抗体（第一抗体（Ab1Ab1）的）的FcFc段结合，经酶催化底物的显段结合，经酶催化底物的显色反应，达到对抗原的检测。色反应，达到对抗原的检测。第三十页，讲稿共六十二页哦（二）技术类型（二）技术类型1.1.酶桥法酶桥法 用辣根过氧化物酶（用辣根过氧化物酶（HRPHRP）免疫动物（如兔）免疫动物（如兔）制备抗制备抗HRPHRP的抗体（的抗体（Ab3Ab3），经），经Ab2Ab2（如羊抗兔）作（如羊抗兔）作桥，将结合在组织抗原上的桥，将结合在组织抗原上的Ab1(Ab1(兔抗相应组织抗兔抗相应组织抗原的抗体原的抗体)与与Ab3Ab3连接起来，最后将连接起来，最后将HRPHRP与与Ab3Ab3结合结合形成形成Ag-Ab1-Ab2-Ab3-HRPAg-Ab1-Ab2-Ab3-HRP复合物，加底物显色复合物，加底物显色 第三十一页，讲稿共六十二页哦第三十二页，讲稿共六十二页哦2.PAP2.PAP法法 即过氧化物酶（即过氧化物酶（P P）-抗过氧化物酶（抗过氧化物酶（APAP）法，为酶）法，为酶桥法的改良，技术要点基本上与酶桥法相同，但该桥法的改良，技术要点基本上与酶桥法相同，但该法将抗酶抗体（抗过氧化物酶（法将抗酶抗体（抗过氧化物酶（APAP）与酶（过）与酶（过氧化物酶（氧化物酶（P P）制成了可溶性复合物）制成了可溶性复合物（PAPPAP）,该复合物由该复合物由2 2个抗酶抗体和个抗酶抗体和3 3个过氧化物个过氧化物酶分子组成，呈五角形，非常稳定。酶分子组成，呈五角形，非常稳定。通过桥抗体（通过桥抗体（Ab2Ab2）将特异性识别组织抗原的抗体）将特异性识别组织抗原的抗体（Ab1Ab1）与）与PAPPAP复合物的抗酶抗体连接起来复合物的抗酶抗体连接起来第三十三页，讲稿共六十二页哦第三十四页，讲稿共六十二页哦第三十五页，讲稿共六十二页哦3.3.双桥双桥PAPPAP法法 该法是该法是PAPPAP法的改良，通过两次连接桥抗体法的改良，通过两次连接桥抗体和和PAPPAP，形成，形成Ag-Ab1-Ab2-PAP-Ab2-PAPAg-Ab1-Ab2-PAP-Ab2-PAP复合物，复合物，在抗原抗体复合物上结合了比在抗原抗体复合物上结合了比PAPPAP法更多的酶分子，法更多的酶分子，大大增强了方法的敏感性。大大增强了方法的敏感性。4.APAAP4.APAAP法法 APAAP APAAP法就是以碱性磷酸酶代替法就是以碱性磷酸酶代替HRPHRP建立的碱建立的碱性磷酸酶（性磷酸酶（APAP）-抗碱性磷酸酶（抗碱性磷酸酶（AAPAAP）法，简）法，简称称APAAPAPAAP法。技术要点与法。技术要点与PAPPAP法相似。法相似。第三十六页，讲稿共六十二页哦（三）方法评价（三）方法评价 该技术既可检测抗原，又可检测抗体。由该技术既可检测抗原，又可检测抗体。由于酶不是标记在抗体上，而是经抗原（酶）抗于酶不是标记在抗体上，而是经抗原（酶）抗体反应与抗酶抗体结合，避免了酶标抗体的缺体反应与抗酶抗体结合，避免了酶标抗体的缺点，提高了方法的敏感性。尤其是双桥点，提高了方法的敏感性。尤其是双桥PAPPAP法，法，是当今免疫组化技术中敏感性较高的方法。是当今免疫组化技术中敏感性较高的方法。第三十七页，讲稿共六十二页哦四、临床应用四、临床应用 酶免疫组织化学检验技术主要用于组织切片或酶免疫组织化学检验技术主要用于组织切片或其它抗原的定性、定位、定量检测。组织切片中各其它抗原的定性、定位、定量检测。组织切片中各类抗原性物质，如各类蛋白质、酶、激素、细胞、类抗原性物质，如各类蛋白质、酶、激素、细胞、病毒、肿瘤抗原、浆细胞中的免疫球蛋白、各种多病毒、肿瘤抗原、浆细胞中的免疫球蛋白、各种多肽、细胞表面标志等均可检测。肽、细胞表面标志等均可检测。第三十八页，讲稿共六十二页哦第三节第三节 荧光免疫组织化学检验技术荧光免疫组织化学检验技术 利用抗原抗体特异性结合的原理，先用荧光素利用抗原抗体特异性结合的原理，先用荧光素标记已知抗体并以此作为探针，检查细胞或组织内标记已知抗体并以此作为探针，检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后，即会发出一定合物中的荧光素受激发光的照射后，即会发出一定波长的荧光，进而对组织中的某种抗原进行定性、波长的荧光，进而对组织中的某种抗原进行定性、定位和定量分析定位和定量分析。第三十九页，讲稿共六十二页哦一、标本制作一、标本制作 常见的临床标本材料主要有组织、细胞和细菌常见的临床标本材料主要有组织、细胞和细菌三大类，按不同标本性质可制作涂片、印片或组织三大类，按不同标本性质可制作涂片、印片或组织切片等。切片等。（一）载玻片和盖玻片的处理（一）载玻片和盖玻片的处理 载玻片和盖玻片要厚薄均匀、洁净及透光性载玻片和盖玻片要厚薄均匀、洁净及透光性好好 第四十页，讲稿共六十二页哦（二）制片（二）制片 1 1组织切片组织切片 组织材料可制备成冰冻切片或石蜡切片。组织材料可制备成冰冻切片或石蜡切片。2 2印片印片 组织材料也可制成印片。组织材料也可制成印片。3 3涂片涂片 细胞或细菌要制成涂片，涂片应薄且均细胞或细菌要制成涂片，涂片应薄且均匀。匀。第四十一页，讲稿共六十二页哦（三）标本的固定（三）标本的固定 主要目的是：主要目的是：1.1.防止细胞或切片从玻片上脱落防止细胞或切片从玻片上脱落 2.2.去除妨碍抗原抗体结合的类脂去除妨碍抗原抗体结合的类脂 3.3.便于保存。除活细胞外，其他标本应在染色便于保存。除活细胞外，其他标本应在染色前以适当的方式固定。前以适当的方式固定。（四）标本片的保存（四）标本片的保存 固定好的标本片应尽快荧光染色检查，如需固定好的标本片应尽快荧光染色检查，如需保存，置保存，置-20-20下低温干燥保存。下低温干燥保存。第四十二页，讲稿共六十二页哦二、荧光抗体标记及染色二、荧光抗体标记及染色 荧光抗体是荧光免疫技术的关键试剂，是荧光抗体是荧光免疫技术的关键试剂，是将荧光素与特异性抗体通过共价键的方式结合将荧光素与特异性抗体通过共价键的方式结合而成。其制备过程通常包括抗体的标记、纯化而成。其制备过程通常包括抗体的标记、纯化和鉴定三步。和鉴定三步。在已固定的标本上滴加经适当稀释的荧光抗体，在已固定的标本上滴加经适当稀释的荧光抗体，置于带盖的湿盒内，置于带盖的湿盒内，3737温育温育30min30min。检测不耐热。检测不耐热抗原以抗原以44过夜为宜。温育后充分洗涤、干燥、镜过夜为宜。温育后充分洗涤、干燥、镜检。检。第四十三页，讲稿共六十二页哦三、临床应用三、临床应用 1.在自身免疫性疾病中的应用在自身免疫性疾病中的应用 2.2.各种病原微生物的快速检查和鉴定各种病原微生物的快速检查和鉴定 3.3.寄生虫感染的诊断寄生虫感染的诊断 4.4.白细胞分化抗原的检测白细胞分化抗原的检测 此外还应用于此外还应用于HLAHLA、肿瘤组织中的肿瘤抗原、肿瘤组织中的肿瘤抗原、组织中的免疫球蛋白和补体组分、激素和酶的定组织中的免疫球蛋白和补体组分、激素和酶的定位等。位等。第四十四页，讲稿共六十二页哦第四节第四节 亲和组织化学检验技术亲和组织化学检验技术 亲和组织化学是利用两种物质之间的高度亲和亲和组织化学是利用两种物质之间的高度亲和力而建立的一种方法。一些具有双价或多价结合力力而建立的一种方法。一些具有双价或多价结合力的物质如生物素、葡萄球菌的物质如生物素、葡萄球菌A A蛋白、植物血凝素等，蛋白、植物血凝素等，对某种组织成分具有高度亲和力，可与蛋白质、对某种组织成分具有高度亲和力，可与蛋白质、糖类、荧光素和酶等多种类型的大小分子结合糖类、荧光素和酶等多种类型的大小分子结合形成相应复合物，采用荧光显微镜、酶加底物形成相应复合物，采用荧光显微镜、酶加底物的显色反应等技术，在细胞或亚细胞水平进行的显色反应等技术，在细胞或亚细胞水平进行对应亲和物质的定位、定性或定量分析。对应亲和物质的定位、定性或定量分析。用于亲和组织化学的物质有生物素与亲和素、用于亲和组织化学的物质有生物素与亲和素、植物凝集素与糖类、植物凝集素与糖类、SPASPA与与IgGIgG、链霉亲和素与生、链霉亲和素与生物素等。物素等。第四十五页，讲稿共六十二页哦一、生物素一、生物素-亲和素法亲和素法 生物素可与蛋白质、糖类和酶等多种类型生物素可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。的大小分子形成生物素化的产物。亲和素也称抗生物素，每个亲和素分子有生亲和素也称抗生物素，每个亲和素分子有生物素结合的物素结合的4 4个位点，二者可牢固结合成不可逆的个位点，二者可牢固结合成不可逆的复合物。复合物。第四十六页，讲稿共六十二页哦常用的技术类型有：常用的技术类型有：1.1.标记亲和素标记亲和素-生物素法（生物素法（LABLAB法）法）将亲和素与标记物（将亲和素与标记物（HRPHRP）结合，一个亲合素）结合，一个亲合素可结合多个可结合多个HRPHRP；将生物素与抗体（一抗与二抗）；将生物素与抗体（一抗与二抗）结合，一个抗体分子可连接多个生物素分子，结合，一个抗体分子可连接多个生物素分子，抗体的活性不受影响。细胞的抗原（或通过一抗体的活性不受影响。细胞的抗原（或通过一抗）先与生物素化的抗体结合，继而将标记亲抗）先与生物素化的抗体结合，继而将标记亲和素结合在抗体的生物素上，如此多层放大，和素结合在抗体的生物素上，如此多层放大，提高了检测抗原的敏感性。提高了检测抗原的敏感性。第四十七页，讲稿共六十二页哦第四十八页，讲稿共六十二页哦2.2.桥连亲和素桥连亲和素-生物素法（生物素法（BABBAB法）法）先使抗原与生物素化的抗体结合，再以游离先使抗原与生物素化的抗体结合，再以游离亲和素将生物素化的抗体与酶标生物素搭桥连亲和素将生物素化的抗体与酶标生物素搭桥连接，也达到多层放大效果。接，也达到多层放大效果。第四十九页，讲稿共六十二页哦第五十页，讲稿共六十二页哦3.3.亲和素亲和素-生物素生物素-辣根过氧化物酶复合物法辣根过氧化物酶复合物法（ABCABC法）法）此法是前两种方法的改进，即先按一定比此法是前两种方法的改进，即先按一定比例将亲和素与酶（辣根过氧化物酶）标生物素例将亲和素与酶（辣根过氧化物酶）标生物素结合在一起，形成亲和素结合在一起，形成亲和素-生物素生物素-辣根过氧化辣根过氧化物酶复合物（物酶复合物（ABCABC复合物），当其与检测反应体系复合物），当其与检测反应体系中的生物素化抗体（直接法）或生物素化第二抗体中的生物素化抗体（直接法）或生物素化第二抗体（间接法）相遇时，（间接法）相遇时，ABCABC中未饱和的亲和素结合部中未饱和的亲和素结合部位即可与抗体上的生物素结合，最终形成晶格样位即可与抗体上的生物素结合，最终形成晶格样结构的复合体，其中网络了大量酶分子，加底物结构的复合体，其中网络了大量酶分子，加底物显色，可大大提高检测抗原的灵敏度。显色，可大大提高检测抗原的灵敏度。第五十一页，讲稿共六十二页哦第五十二页，讲稿共六十二页哦二、二、SPA法法 SPA SPA具有和人及许多动物如豚鼠、猪、小鼠、具有和人及许多动物如豚鼠、猪、小鼠、猴等的猴等的IgG FcIgG Fc结合的能力，这种结合不会影响抗结合的能力，这种结合不会影响抗体的活性。每个体的活性。每个SPASPA分子可同时结合两个分子可同时结合两个IgGIgG分子，分子，也可一方面同也可一方面同IgGIgG相结合，一方面与标记物如荧相结合，一方面与标记物如荧光素、过氧化物酶、胶体金和铁蛋白等相结合。光素、过氧化物酶、胶体金和铁蛋白等相结合。第五十三页，讲稿共六十二页哦第五十四页，讲稿共六十二页哦三、链霉亲和素三、链霉亲和素生物素技术生物素技术 链霉亲和素与生物素的结合是已知自然界链霉亲和素与生物素的结合是已知自然界中最强的非共价相互作用之一，其功能类似亲中最强的非共价相互作用之一，其功能类似亲和素。利用生物素结合的二抗与酶标记的链霉和素。利用生物素结合的二抗与酶标记的链霉亲和素蛋白就组成酶标链霉亲和素亲和素蛋白就组成酶标链霉亲和素-生物素方法生物素方法（LSABLSAB）。）。LSAB LSAB法的特点法的特点:特异性强；特异性强；分子量小，分子量小，穿透力强，放大效应远超穿透力强，放大效应远超ABCABC法，故其敏感性更法，故其敏感性更强；强；等电点中性更适合组织，可明显减少非等电点中性更适合组织，可明显减少非特异性染色，低背景着色使特异性着色更清晰；特异性染色，低背景着色使特异性着色更清晰；操作时间缩短，更简便。操作时间缩短，更简便。第五十五页，讲稿共六十二页哦第五十六页，讲稿共六十二页哦四、凝集素法四、凝集素法 一种凝集素具有专一性结合某种特异性糖基一种凝集素具有专一性结合某种特异性糖基的能力，同时所有生物膜都含有一定量的糖类，的能力，同时所有生物膜都含有一定量的糖类，后者主要以糖蛋白和糖脂的形式存在。因此，凝后者主要以糖蛋白和糖脂的形式存在。因此，凝集素可作为一种探针来研究细胞膜上特定的糖基。集素可作为一种探针来研究细胞膜上特定的糖基。另一方面，凝集素具有多价结合能力，能与荧光另一方面，凝集素具有多价结合能力，能与荧光素、生物素、酶、胶体金和铁蛋白等示踪物结合，素、生物素、酶、胶体金和铁蛋白等示踪物结合，从而在光镜或电镜水平显示其结合部位。从而在光镜或电镜水平显示其结合部位。第五十七页，讲稿共六十二页哦 一般认为细胞膜上特定的糖基可用以区别细胞一般认为细胞膜上特定的糖基可用以区别细胞的类型并反映细胞在分化、成熟和细胞病变中的的类型并反映细胞在分化、成熟和细胞病变中的变化。变化。标记了相应示踪物的凝集素可用来：标记了相应示踪物的凝集素可用来：作为细胞分化和成熟的标记作为细胞分化和成熟的标记 作为细胞特殊类型的标记作为细胞特殊类型的标记 肿瘤细胞伴有细胞膜的改变，细胞膜上的糖基肿瘤细胞伴有细胞膜的改变，细胞膜上的糖基也会产生相应的变化，也可用凝集素检测出肿瘤细也会产生相应的变化，也可用凝集素检测出肿瘤细胞。胞。第五十八页，讲稿共六十二页哦常用下列染色法：常用下列染色法：直接法直接法标记物直接标记在凝集素上，使之标记物直接标记在凝集素上，使之直接与切片中的相应糖蛋白或糖脂相结合直接与切片中的相应糖蛋白或糖脂相结合 间接法间接法将凝集素直接与切片中的相应糖基将凝集素直接与切片中的相应糖基结合，而将标记物结合在抗凝集素抗体上结合，而将标记物结合在抗凝集素抗体上 糖糖凝集素凝集素糖法糖法 本法是利用过量的凝集本法是利用过量的凝集素与组织切片中特定的糖基相结合，经冲洗后，素与组织切片中特定的糖基相结合，经冲洗后，凝集素上还存在未被占用的结合部位，未结合部凝集素上还存在未被占用的结合部位，未结合部位与有过氧化物酶标记的特异性糖基相结合，形位与有过氧化物酶标记的特异性糖基相结合，形成一个成一个“三明治样三明治样”的糖的糖凝集素凝集素糖的结合物。糖的结合物。第五十九页，讲稿共六十二页哦第五节第五节 其他免疫组织化学检验技术其他免疫组织化学检验技术一、金免疫组织化学技术一、金免疫组织化学技术 免疫胶体金技术是以胶体金作为标记物。胶免疫胶体金技术是以胶体金作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性没有明显的影响。因此，白，对蛋白的生物学活性没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子疫球蛋白的分子(如如SPA)等作为探针，能对组织等作为探针，能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位或定量研究。或细胞内的抗原进行定性、定位或定量研究。第六十页，讲稿共六十二页哦（一）免疫金（银）光镜染色技术（一）免疫金（银）光镜染色技术 基本原理是通过免疫反应沉积在抗原位置的基本原理是通过免疫反应沉积在抗原位置的胶体金颗粒起着一种催化剂作用，用对苯二酚胶体金颗粒起着一种催化剂作用，用对苯二酚还原剂将银离子还原剂将银离子(Ag(Ag)还原成银原子还原成银原子(Ag)(Ag)，被还，被还原的银原子围绕金颗粒形成一个原的银原子围绕金颗粒形成一个“银壳银壳”，“银银壳壳”一旦形成，本身亦具有催化作用，从而使更一旦形成，本身亦具有催化作用，从而使更多银离子还原并促使多银离子还原并促使“银壳银壳”不断变大，最终不断变大，最终使抗原位置得到更清楚的放大，在光镜下就可使抗原位置得到更清楚的放大，在光镜下就可观察到被放大的抗原位置呈现黑色或黑褐色。观察到被放大的抗原位置呈现黑色或黑褐色。第六十一页，讲稿共六十二页哦第六十二页，讲稿共六十二页哦