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现代仪器分析第1页，本讲稿共33页Introduction Ultraviolet-visible spectroscopy or ultraviolet-visible spectrophotometry(UV-Vis or UV/Vis)refers to absorption spectroscopy in the UV-visible spectral region.This means it uses light in the visible and adjacent(near-UV and near-infrared(NIR)ranges.The absorption in the visible range directly affects the perceived color of the chemicals involved.In this region of the electromagnetic spectrum,molecules undergo electronic transitions(跃迁).This technique is complementary(补充)to fluorescence spectroscopy,in that fluorescence deals with transitions from the excited state to the ground state,while absorption measures transitions from the ground state to the excited state.第2页，本讲稿共33页分子光谱概述分子光谱概述E分子分子=E电子电子+E振动振动+E转动转动E电子电子E振动振动E转动转动 E=hv比原子光谱复杂得多比原子光谱复杂得多带状光谱（包含电子、振动、转动光谱）带状光谱（包含电子、振动、转动光谱）分子光谱的产生分子光谱的产生第3页，本讲稿共33页第4页，本讲稿共33页分子光谱类型分子光谱类型转动光谱（远红外光谱）：能级差转动光谱（远红外光谱）：能级差0.005-0.05eV，吸收，吸收波长波长25-250m的远红外光。的远红外光。振动光谱（红外光谱）：能级差振动光谱（红外光谱）：能级差0.05-1eV，吸收波长，吸收波长1.25-25m的红外光。此种跃迁包含了转动光谱。的红外光。此种跃迁包含了转动光谱。电子光谱（紫外电子光谱（紫外可见吸收光谱）：能级差可见吸收光谱）：能级差1-20eV，吸，吸收波长收波长0.06-12.5m的紫外、可见光。此种跃迁包含了大的紫外、可见光。此种跃迁包含了大量的振动、转动光谱，是为带状光谱。量的振动、转动光谱，是为带状光谱。辐射区域真空紫外紫外可见红外微波波长（nm)10-200200-400400-7500.75-1000mcm 级光谱类型电子电子电子振-转转动第5页，本讲稿共33页实例实例-胡罗卜素胡罗卜素咖啡因咖啡因阿斯匹林阿斯匹林丙酮丙酮第6页，本讲稿共33页光谱吸收定律光谱吸收定律朗伯朗伯-比尔定律比尔定律The Beer-Lambert law states that the absorbance of a solution is directly proportional to the concentration of the absorbing species in the solution and the path length.Thus,for a fixed path length,UV/VIS spectroscopy can be used to determine the concentration of the absorber in a solution.It is necessary to know how quickly the absorbance changes with concentration.A UV/Vis spectrophotometer may be used as a detector for HPLC.The presence of an analyte(被分析物)gives a response assumed to be proportional to the concentration.For accurate results,the instruments response to the analyte in the unknown should be compared with the response to a standard;this is very similar to the use of calibration curves.The response(e.g.,peak height)for a particular concentration is known as the response factor.第7页，本讲稿共33页光谱吸收定律光谱吸收定律朗伯朗伯-比尔定律比尔定律A=(I0/I)=a b cwhere A is the measured absorbance(吸光度),I0 is the intensity of the incident light(入射光)at a given wavelength,I is the transmitted intensity(透射光),a 吸光系数（l g-1 cm-1）；b 吸收池厚度（cm）；c 被测物质浓度（g l-1）；透射比透射比T=I/I0，T%为百分透光率为百分透光率,（1-T%）为百分吸收率）为百分吸收率A=(I0/I)=L cFor each species and wavelength,(l mol-1 cm-1)is a constant known as the molar absorptivity(摩尔吸光系数)or extinction coefficient(消光系数).L(cm)is the pathlength(光程)through the sample,and c(mol l-1)is the concentration of the absorbing species.第8页，本讲稿共33页电子光谱产生电子光谱产生有机化合物的电子光谱有机化合物的电子光谱能级高低 n*可能的跃迁类型-*-*-*n-*-*n-*跃迁类型跃迁类型第9页，本讲稿共33页跃迁类型跃迁类型-*：C-H共价键，如共价键，如CH4（125nm）；C-C键，如键，如C2H6(135nm)，处于，处于 真空紫外区；真空紫外区；-*和和-*跃迁：尽管所需能量比上述跃迁：尽管所需能量比上述-*跃迁能量小，但波长仍处于跃迁能量小，但波长仍处于 真空紫外区；真空紫外区；n-*：含有孤对电子的分子，如含有孤对电子的分子，如H2O(167nm)；CH3OH(184nm)；CH3Cl (173nm);CH3I(258nm)；(CH3)2S(229nm)；(CH3)2O(184nm)CH3NH2(215nm)；(CH3)3N(227nm)，可见，大多数波长仍小于可见，大多数波长仍小于 200nm，处于近紫外区。，处于近紫外区。以以上上四四种种跃跃迁迁都都与与 成成键键和和反反键键轨轨道道有有关关（-*，-*，-*和和n-*），跃跃迁迁能能量量较较高高，这这些跃迁些跃迁所产生的吸收谱多位于真空紫外区，因而在此不加讨论。所产生的吸收谱多位于真空紫外区，因而在此不加讨论。只只有有-*和和n-*两两种种跃跃迁迁的的能能量量小小，相相应应波波长长出出现现在在近近紫紫外外区区甚甚至至可可见见光光区区，且且对对光的吸收强烈，是我们研究的重点。光的吸收强烈，是我们研究的重点。第10页，本讲稿共33页几个概念几个概念生色团：生色团：可以吸收光子产生跃迁的基团，一般都是带可以吸收光子产生跃迁的基团，一般都是带有不饱和键的官能团，如烯、炔、羰基、硝基等。有不饱和键的官能团，如烯、炔、羰基、硝基等。助色团：助色团：带有非键电子对的基团，如带有非键电子对的基团，如OH，OR，NHR，SH，X等，本身不吸收等，本身不吸收 200nm的光，的光，但会使生色团的吸收峰向长波方向移动，并增加吸收强但会使生色团的吸收峰向长波方向移动，并增加吸收强度。度。红移与紫移：红移与紫移：因取代基或溶剂因素使吸收带向向长波因取代基或溶剂因素使吸收带向向长波方向移动称为方向移动称为红移红移，向短波方向移动称为，向短波方向移动称为紫移紫移第11页，本讲稿共33页主要有机物主要有机物-烃及其衍生物烃及其衍生物饱和烃及衍生物：只有饱和烃及衍生物：只有*跃迁，跃迁，max150nm,已经超已经超出测量范围，因此可作为溶剂。出测量范围，因此可作为溶剂。不饱和烃及共轭烯烃：有不饱和烃及共轭烯烃：有*和和*跃迁，乙烯中的跃迁，乙烯中的*跃迁跃迁max=180nm。当有共轭体系时，。当有共轭体系时，max向长波向长波方向移动方向移动(红移红移)，同时吸收增强。，同时吸收增强。共轭体系中的共轭体系中的*跃迁吸收带称为跃迁吸收带称为K带。带。化合物溶剂max/nmmax1,3-丁二烯己烷217210001,3,5-己三烯异辛烷268430001,3,5,7-辛四烯环己烷304-1,3,5,7,9-葵五烯异辛烷3341210001,3,5,7,9,11-十二烷六烯异辛烷364138000第12页，本讲稿共33页主要有机物主要有机物-羰基化合物羰基化合物羰基化合物（羰基化合物（C=O键）键）:主要有主要有n*,n*,*跃迁跃迁,n*又称又称R带带.一般在近紫外或紫外区一般在近紫外或紫外区.而醛酮而醛酮(270-300nm)与羧酸及其衍生物的结构不同与羧酸及其衍生物的结构不同,R带有差异带有差异.,-不饱和醛酮具有不饱和醛酮具有共轭体系共轭体系,使使*跃迁移到跃迁移到220-260nm,n*移到移到310-330nm,同时吸收增强同时吸收增强.,-不饱和醛酮不饱和醛酮*吸收带高吸收带高(max104),n*吸收带吸收带低低(max102),是识别之特征是识别之特征.羧酸及其衍生物的羧酸及其衍生物的n*吸收带受助色团影响吸收带受助色团影响(-OH,-X,-OR,-NH2),使使n*吸收带紫移至吸收带紫移至210nm.第13页，本讲稿共33页主要有机物主要有机物-苯及其衍生物苯及其衍生物苯有苯有3个吸收带个吸收带,均是均是*跃迁产生跃迁产生.E1带带:180nm(max=60000);E2带带:204nm(max=8000);B带带:255nm(max=200).当苯环上有取代基时当苯环上有取代基时,三个特征峰发生显著变化三个特征峰发生显著变化,其中影响其中影响较大的是较大的是E2带和带和B带带.稠环芳烃和杂环在苯环的基础上发生变化稠环芳烃和杂环在苯环的基础上发生变化.第14页，本讲稿共33页无机化合物的电子光谱无机化合物的电子光谱电荷迁移跃迁电荷迁移跃迁:无机配合物的中心离子与配体之间的电子跃迁无机配合物的中心离子与配体之间的电子跃迁.尤尤其是过渡金属离子其是过渡金属离子(具有具有d110电子结构电子结构),因此多具有颜色因此多具有颜色.波长波长取决于中心离子与配体之间的电子能级差取决于中心离子与配体之间的电子能级差,特点是吸收强度特点是吸收强度大大(max104),可用作定量分析可用作定量分析.配位场跃迁配位场跃迁:过渡元素的过渡元素的d d和镧系和镧系,锕系元素的锕系元素的 f f跃迁跃迁.一般位一般位于可见光区于可见光区,吸收较弱吸收较弱(max102),是研究配合物结构理论的重要信是研究配合物结构理论的重要信息息.第15页，本讲稿共33页溶剂的影响溶剂的影响 对光谱的影响（红移或紫移）和对测定的影响对光谱的影响（红移或紫移）和对测定的影响 选择溶剂时须注意：选择溶剂时须注意：（1）尽量选低极性溶剂；）尽量选低极性溶剂；（2）能很好的溶解物质，且形成的溶液有好的化）能很好的溶解物质，且形成的溶液有好的化 学和光化学稳定性；学和光化学稳定性；（3）在样品的光谱区无明显吸收。）在样品的光谱区无明显吸收。第16页，本讲稿共33页仪器组成类型仪器组成类型主要组成部件主要组成部件光电倍增管和光电管光源光源单色器单色器样品池样品池检测器检测器显示器显示器钨灯(可见,近红外)和氘灯(紫外)连续,稳定,恒定,长命棱镜(可见玻璃,紫外石英)和光栅玻璃和石英吸收池(1-10cm)表盘或数显第17页，本讲稿共33页仪器组成类型仪器组成类型仪器类型仪器类型单波长双光束:UV-2450,UV-9100,UV-1100等.两光束同时通过参照池和样品池,消除了光源强度变化的误差.双波长:UV-200,UV-240等.两个不同波长的单色光交替照射同一溶液,得到A=A(1)-A(2).可测定高浓度,多组分混合或相互干扰的样品.单波长单光束:国产721,722,751等双光束/双波长:具有双光束和双波长双种功能.能记录吸光度随时间的变化曲线,因此可用于化学反应动力学研究.第18页，本讲稿共33页应用实验技术应用实验技术实验技术实验技术样品的制备样品的制备 在溶液中进行在溶液中进行无机物 水溶、酸溶或碱熔等；有机物 溶剂溶解或抽提，也可消化后溶解；溶 剂 前述三点（低极性、溶解且无吸收、稳定）+挥发小、不易燃、无毒性、价格便宜等。第19页，本讲稿共33页测定条件的选择测定条件的选择（1）波长的选择 一般为最大吸收波长（灵敏、稳定）（2）狭缝的选择 影响灵敏度和线性范围（不减少A的最大狭缝）（3）吸光度选择 吸光度在0.2 0.8 时，测量误差最小由由L-B定律：定律：微分后得：微分后得：将上两式相比，并将将上两式相比，并将 dT 和和 dc 分别换为分别换为 T 和和 c，得，得当相对误差当相对误差 c/c 最小时，求得最小时，求得T=0.368 或或 A=0.434。即当。即当A=0.434 时，吸光度读数误时，吸光度读数误差最小！差最小！通常可通过调节溶液浓度或改变光程通常可通过调节溶液浓度或改变光程b来控制来控制A的读数在的读数在0.151.00范围内范围内.第20页，本讲稿共33页反应条件的选择反应条件的选择（1）溶液的酸度 影响吸收曲线（2）显色剂浓度 高灵敏度且吸光度恒定（3）温度的影响（4）显色时间 反应的时间及络合物的稳定性（5）参比溶液 试液和显色剂均无色 蒸馏水为参比；显色剂无色,试液中有其它有色离子 不加显色剂的试液；试液、显色剂均有色 取一份试液,加掩蔽剂掩蔽被测离子,再加显色剂等.第21页，本讲稿共33页共存离子干扰的消除方法共存离子干扰的消除方法（1）加入适当的掩蔽剂（2）改变干扰离子的价态 如铬天青S测定Al（）时，Fe（）有干扰，可加入抗坏血酸还原铁而消除干扰.（3）选择适当的波长（4）其它 各种预分离技术第22页，本讲稿共33页分析应用分析应用定性分析定性分析（1）比较（吸收光谱曲线）法 与已知物或标准谱图比较.Sadtler(萨特勒萨特勒)Standard Spectra(Ultraviolet)，有，有46000种化合物的紫外光谱种化合物的紫外光谱（2）用各种经验规则计算max，并与实测值比较 Woodward(伍德沃德)规则 计算共轭二烯、多烯烃、共轭烯酮 Scott(斯科特)规则 计算芳香族羰基的衍生物第23页，本讲稿共33页（3）有机物构型和构象的确定（顺反、互变）如：顺反式、酮式-烯醇式互变异构等 （4）纯度检查 如：通过测定吸收曲线 通过测 来判断 干性油（含共轭双键）与不干性油（饱和或双键不共轭）的判别 第24页，本讲稿共33页定量分析定量分析（1）单一物质的分析）单一物质的分析 A =abc标准曲线法：常规分析方法标准对比法：只有1个标准溶液。被测浓度要与标准溶液浓度大致相当。标准加入法（增量法）：当标准溶液与被测溶液组成不一致时使用，可以消除其他组分的影响，其原理与原子吸收中的方法相同。第25页，本讲稿共33页（2）多组分的分析）多组分的分析解联立方程组法 吸光度的加合性原则 （二组分混合物的紫外、可见吸收光谱可分为：不重叠、部分重叠、相互重叠三种）（n组分时为n元方程组）不重叠不重叠部分重叠部分重叠相互重叠相互重叠相互重叠相互重叠第26页，本讲稿共33页（3）示差分光光度法）示差分光光度法提高分析准确度提高分析准确度测量原理：当试样中组份的浓度过大时，则A值很大，会产生读数误差。此时若以一浓度略小于试样组份浓度作参比，则有：具体做法：以浓度为c cs s的标准溶液调T=100%或A=0（调零），所测得的试样吸光度实际就是上式中的A，然后求出c c，则试样中该组份的浓度为(c cs s+c c)。第27页，本讲稿共33页应用实例应用实例（1）Folin 酚法测定蛋白质含量酚法测定蛋白质含量（2）考马斯亮蓝法测定蛋白质）考马斯亮蓝法测定蛋白质原理：在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色配合物，该配合物在与还原磷钼酸磷钨酸试剂反应生成深蓝色溶液，在640nm下测定。颜色深浅与蛋白质浓度成正比，可定量分析。原理：考马斯亮蓝在465nm处有最大吸收。它与蛋白质形成复合物后max红移至595nm，且颜色深浅与蛋白质浓度成正比，可定量分析。第28页，本讲稿共33页补充：荧光分析法在生物学上的应用补充：荧光分析法在生物学上的应用测定细胞内钙离子浓度测定细胞内钙离子浓度荧光探针分子结合钙离子后，其光谱和荧光强度会发生显著位移和增强，可应用于细胞内钙离子浓度变化。第29页，本讲稿共33页细胞膜微黏度测定细胞膜微黏度测定荧光体的各向异性与溶液的黏度有关。通过标准曲线法测定细胞膜内双分子层的微黏度。特别是测定不同温度下膜脂的黏度，是评价生物膜系统对逆境胁迫下（如温度）膜脂相变和膜脂流动性的重要手段。第30页，本讲稿共33页研究酶的变构效应研究酶的变构效应荧光探针对环境变化特别敏感，所以可应用于大分子的构象变化。第31页，本讲稿共33页细胞色素细胞色素P450结构特征及其抑制剂的筛选结构特征及其抑制剂的筛选细胞色素P450在甾体和二十烷类化合物的生物合成中起到重要作用，也是研究药物的设计靶标。肝中的P450同工酶几乎参与了所有的药物代谢过程。用荧光探针分子可检测荧光强度的猝灭及加入抑制剂后的恢复，以此筛选抑制剂和药物靶标。第32页，本讲稿共33页Thank you for attention第33页，本讲稿共33页