《荧光分光光度法》PPT课件.ppt

第第六六章章 荧光分光光度法荧光分光光度法 l基本要求：了解荧光光谱法的基本原理和应用特点。了解荧光分光光度计的组成以及特点。掌握荧光光谱法的定量分析方法。了解影响荧光强度的因素。第一节第一节 概论概论 回顾：四大类电化学分析法光学分析法色谱分析法其它分析方法 原子光谱法 分子光谱法 X射线光谱法 核磁波谱法 紫外-可见光分光光度法 荧光分光光度法红外吸收光谱法 拉曼光谱法 一、应用：一、应用：1.定量分析 能产生荧光 或能形成荧光配合物的物质。2.简单定性 回答“是不是”。二、特点：二、特点：灵敏度高，比吸收光谱法高10104倍。ppb选择性比吸收光谱法好。第二节第二节 基本原理基本原理 一、分子荧光的产生一、分子荧光的产生 物质吸收光辐射 价电子从基态跃到激发态，然后再回到基态 释放能量以热能的形式。以光辐射的形式。以光辐射形式释放能量时，发射荧光。这种现象称为光致发光。荧光磷光无辐射跃迁激发态亚稳态（三重态）基态 最常见的光致发光：荧光和磷光。两者发光机理不同，寿命不同。荧光寿命10-910-6秒，磷光寿命10-310秒。荧光可由激发态的分子产生，也可由激发态的原子产生，本章介绍分子荧光。由于荧光的产生由价电子引起，所以，荧光光谱属于电子光谱，其波长范围位于：紫外光区和可见光区。二、激发光谱和发射光谱二、激发光谱和发射光谱 激发光谱激发光谱 固定荧光波长，以激发光波长对荧光强度(F)所作的光谱曲线。300350400(nm)F【例】硫酸奎宁（0.1mol/L硫酸溶液）的激发光谱。发射光谱发射光谱 固定激发光波长，以荧光波长对荧光强度F所作的光谱曲线。300350400(nm)F【例】蒽（乙醇溶液）的发射光谱。三、分子荧光与分子结构的关系三、分子荧光与分子结构的关系 分子要产生荧光，首先要能吸收紫外光或可见光。能产生荧光的分子具有的结构特点：共轭双键刚性平面多环结构【例】芴具有刚性平面，产生的荧光比联二苯强。四、荧光强度与浓度的关系四、荧光强度与浓度的关系：量子效率，发射光量子与吸收光量子之比。I0：入射光强度：摩尔吸光系数 b：光程 c：浓度0bc公式成立前提条件：bc 即：当试样浓度较低时（c0.05/b），C与F方成线性。（如果浓度过高，分子碰撞机会增大，而产生无辐射去激活，造成线性偏离。）第三节第三节 荧光分光光度计荧光分光光度计 一、基本结构示意图一、基本结构示意图 特点：1 光源方向与检测方向成直角；2 二个单色器。显示器检测器荧光单色器样品池激发光单色器光源二、主要部件及功能二、主要部件及功能 1光源光源高压汞蒸气灯，氙灯。能提供紫外光和可见光，光强度比紫外-可见光分光光度计光源大得多。2激发光单色器激发光单色器作用：提供单波长的激发光。色散元件：棱镜或光栅。出射狭缝宽度可调。3样品池样品池须用石英材料制成。4荧光单色器荧光单色器将样品池中的散射光、反射光、杂质荧光等滤掉，只让荧光通过。出射狭缝宽度可调。5检测器检测器光电转换元件，测定荧光的强度。检测方向与激发光方向垂直：在垂直方向上没有透过光的干扰。由于荧光的强度较弱，一般以光电倍增管作检测器。第四节第四节 定量分析定量分析 一、定量方法一、定量方法 一般采用工作直线法。作CF直线。FC配制一系列待测成分的标准溶液 C1 C2 C3 C4 C5测出相应的荧光强度 F1 F2 F3 F4 F5建立工作直线（F C）作图法 回归法测量待测样品，得F样 从工作直线上找到待测成分的浓度C样 由回归方程计算出C样二、影响荧光强度测定的因素二、影响荧光强度测定的因素 1激发光照射激发光照射有一些荧光物质若受到强光照射，会发生分解而导致F。所以，荧光分光光度计通常在激发光单色器后装配有光闸，在测定时才打开光闸让激发光照射样品池。2温度温度温度，荧光效率下降，F。（因为，温度，增加分子间碰撞机会而使能量消耗掉。）4溶剂溶剂 有些溶剂会使荧光效率下降，也可能带来干扰荧光。苯胺pH712时，发兰色荧光。pH2或PH13时，无荧光。【例】所以，有时需要pH缓冲液控制pH值在适当范围内。3pH值值 pH值能改变某些荧光物质的电子构型从而影响荧光强度。l灵敏度高。可高达ppb级（10-9），甚至ppt级（10-12）。l选择性好，与能产生荧光的物质少有关。三、定量分析的特点及应用三、定量分析的特点及应用 思考题一、概念l（荧光）激发光谱l（荧光）发射光谱二、问答题l试述分子荧光产生的过程。l试述分子荧光强度与浓度的关系式，并说明公式成立的前提条件及原因。l分别说明荧光分光光度计两个单色器的作用，以及将光路设计成直角方向的原因。l为什么可见光分光光度计的光路是直线方向，而荧光分光光度计的光路是直角方向？荧光分析的激发光谱和发射光谱分别提供了哪些定量分析信息？核黄素的激发光谱（实线）和发射光谱（虚线）如图所示，对核黄素进行荧光定量分析时，最佳的激发光波长和荧光波长各为多少？为什么？