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微生物的遗传变异与育种微生物的遗传变异与育种本章内容：基因突变与诱变育种基因重组菌种的衰退、复壮及保藏2.2.涂布试验涂布试验基因突变与诱变育种1、突变与噬菌体无关；2、涂布使抗性菌株均匀分布；3、抗性突变可在任何时间发生，与噬菌体存在无关。以上实验用统计学原理间接证明。3.3.平板影印平板影印基因突变与诱变育种实验表明：从未接触 str 的菌株可发生抗性突变，分离可得到纯的 str r 菌株。由此表明：突变是自发的与环境不对应的。基因突变与诱变育种（四）基因突变的机制：（自学）（五）紫外线(U.V)对DNA的损伤及修复:（自学）二、突变与育种二、突变与育种（一）自发突变与生产育种基因突变与诱变育种1.生产选育：群体培养中个别的变异个体表现出 生长优势，发现突变种后，随时分离、纯化。2.定向培育：用特定的环境长期处理某一微生物 群体,同时不断对其移种、传代，以达到积累 和选择合适的自发突变 体的一种育种方法.3、自发突变的机制：自发突变(spontaneous)：在非人为的情况下由于 遗传 物质的微小变化引起的性状变异。原因可能是：1）环境因素；2）自身有毒产物的积累；3）互变异构效应；4）环出效应等。基因突变与诱变育种（二）诱变育种1.概念：诱变育种是用物理或化学的诱变剂使诱变对象内的遗传物质（DNA）的分子结构发生改变，引起性状变异并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。基因突变与诱变育种2.诱变剂：2）种类：物理因子（phisical agents)化学因子(chemical agents)转座子(transposable elements)物理诱变剂：U.V、快中子、超声波等。基因突变与诱变育种1）概念：凡能提高基因突变频率的理化因素。化学诱变剂：烷化剂(alkylating agents)：如：氮芥、硫酸二乙酯、亚硝基胍、NTG等 机制：将烷烃加在含氮碱基上，改变氢键性质 碱基类似物(base analogs)：如：叠氮胸腺嘧啶（AIT）等；机制：在DNA复制时将碱基类似物插入DNA中，而碱 基类似物没有正常碱基的氢键性质，在DNA复 制时出现突变体。基因突变与诱变育种 插入剂(intercalating agents):如：溴化乙啶等一些三环分子。机制：与DNA中的一对碱基有大致相同的位点，这些分子 不改变碱基的氢键性质，而插入在双螺旋中，加宽间 距，引起碱基增加。基因突变与诱变育种3.诱变程序：基因突变与诱变育种原始菌种纯化斜面/肉汤培养单孢子/单细胞悬液诱变剂处理平板分离移至斜面小试中试初筛复筛计算存活率观察形态变异，挑单菌落良种保藏原菌种特性鉴定4.诱变的主要环节1）诱变剂的选择：基因突变与诱变育种1.a.了解诱变剂的性质、作用机理和使用方法2.b.处理方式：3.单一因子处理：4.复合因子处理：两种以上因素先后使用同时使用单一因子重复使用c.处理剂量：测致死率。方法平板菌落计数法纸片法一般杀菌率为70%左右。基因突变与诱变育种Ames testAmes test：对化学诱变剂做检测：对化学诱变剂做检测菌种：鼠伤寒沙门氏菌 his-；原理：his-在基本培养基上不长；而发生回复突变则长。基因突变与诱变育种Ames test Ames test 方法示意图方法示意图用于检测食品、饮料、药物和饮水等样品的中致癌物基因突变与诱变育种2）出发菌株：育种的原始菌种；应具备：a.对诱变剂的敏感性高；b.生产中选育过的自发变异菌株；c.本身具有一些有利性状；d.对代谢产物有一定积累；e.已经发生过某些变异。基因突变与诱变育种3）单孢子或单细胞悬液的制备a.必要性：单细胞可以均匀地接触诱变剂 避免出现不纯的菌落菌种退化基因突变与诱变育种b.制备：物理诱变剂生理盐水（0.85%NaCl)化学诱变剂缓冲液 c.方法：三角瓶内加0.5cm玻璃珠打散10-15min;加.3%吐温80（表面活性剂）用无菌脱脂棉过滤。d.浓度：细菌、放线菌 108个/ml 霉菌、酵母菌 106个/ml基因突变与诱变育种4)设计和采用效率高的筛选方案和方法初筛：平板上做定性、半定量的测定，观察突变株 的生理效应范围。方法：梯度平板法；（抗性菌株）纸片法；（抗性菌株）透明圈法；（淀粉酶产生菌株等）变色圈法；（氨基酸生产菌株）基因突变与诱变育种如：用梯度平板法筛选抗性菌株基因突变与诱变育种抗生素法直接筛选抗药性突变体基因突变与诱变育种 复筛：较精确的生物化学分析方法 做摇瓶测定（见P250）基因突变与诱变育种三、营养缺陷型的筛选三、营养缺陷型的筛选（一）概念：基因突变与诱变育种1.三种遗传型个体营养缺陷型（auxotroph）：经诱变产生的一些合成能 力出现缺陷，而必须在培养基内加入相应 有机养分才能正常生长的变异菌株。如：lys-;bio-;野生型(wild type)：自然界分离到的任何微生物，在 其发生营养缺陷突变前的原始菌株，为 该微生物的野生型。如：lys+;bio+;原养型(prototroph)：指auxo突变菌株回复突变或重组 后产生的菌株，与野生型的表型相同。2、筛选用的培养基基本培养基（minimal medium,MM）-：满足野生 型菌株营养要求最低成分的组合。完全培养基（complete medium,CM）+：满足一 切auxo生长的天然或半组合培养基。补充培养基（supplemented medium,SM）x：在 MM中有针对性地加入一或几种营养成 分以满足相应 auxo生长的组合培养基。基因突变与诱变育种（二）筛选方法auxo的鉴定 基因突变与诱变育种诱变处理auxo的浓缩auxo的检出1.1.诱变处理（同前）诱变处理（同前）auxoauxo的筛选程序：的筛选程序：基因突变与诱变育种细菌培养离心洗涤诱变处理CM后培养洗涤MM加PN涂布于CM平板影印培养挑取鉴定菌种保存2.2.auxoauxo的浓缩：的浓缩：基因突变与诱变育种1）抗生素法：原理：青霉素、制霉菌素等抗生素作用于生长着的微生物细胞，对休止态细胞无作用。方法：菌培养在含抗生素的MM基中。2）菌丝过滤法：适用于丝状（放线菌、霉菌）原理：基本培养基上只有发育成菌丝；auxo孢子可通过滤膜，野生型菌丝不能通过。基因突变与诱变育种3）差别杀菌法：基本培养基上只有野生型生长，加热杀死野生型营养体，保留auxo芽孢。细菌80酵母60 适用于产芽孢、孢子菌。基因突变与诱变育种3.3.auxo auxo的检出的检出1）逐个检出法基因突变与诱变育种2）影印平板培养法3）限量补充法 （在mm中加0.01%蛋白胨，auxo菌落小，野生型菌落大）基因突变与诱变育种3）夹层培养法4.4.auxo auxo的鉴定的鉴定基因突变与诱变育种1）生长谱法方法简便；回变和污染不影响 结果测定物质可为粉末 或纸片混合氨基酸法步骤：a.将多种营养因子编组，如：一组：1 2 3 4 5 二组：2 6 7 8 9 三组：3 7 10 11 12 四组：4 8 11 1313 14 五组：5 9 12 14 15基因突变与诱变育种2）混合氨基酸（Vit）法1）每组内无重复的营 养因子2）每组中应包含只出 现一次的因子3）每组中其他因子应 分别出现二次营养因子分组编排时注意：基因突变与诱变育种b.将组合液的纸片放在涂菌的基本培养基上培养c.结果分析a.将多种营养因子编组，如：一组：1 2 3 4 5 二组：2 6 7 8 9 三组：3 7 10 11 12 四组：4 8 11 1313 14 五组：5 9 12 14 155.5.auxoauxo 的应用的应用1）作为标记菌株：进行基因工程、诱变育种、代谢过程的研究中的亲本标记；2）作为生产菌种：aa、核苷酸等生产菌种；3）作为aa、维生素、碱基的测定菌株。基因突变与诱变育种第二节 基因重组 本节内容：原核生物的基因重组 真核生物的基因重组基因重组：把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经遗传物质重新组合后，形成新遗传型个体的方式。基因重组分子水平的杂交一般杂交细胞水平基因重组甲生长快、产量低乙生长慢、产量高基因重组基因重组如：生长快、产量高一、原核生物的基因重组一、原核生物的基因重组（一）转化（transformation)基因重组 受体菌(receptor)直接吸收来自供体菌(donor)的DNA片段，通过交换，将其整合到自己的基因组中，再经复制就使自己变成一个转化子(transformation)。这种受体菌接受供体菌的DNA片段而获得部分新的遗传性状的现象，称转化或转化作用。概念：1.感受态基因重组 不同菌株的亲缘关系 受体细胞是否处于感受态感受态：受体细胞最易接受外源DNA片段并实 现其转化的一种生理状态。不同菌出现感受态的时间不同。转化的决定因素：2.感受态因子一种胞外蛋白质，分子量为510kD基因重组其作用为：催化转化，促进外来DNA片段吸收可降解细胞表面某种成分，使DNA受体暴露 1）不同菌细胞DNA受体位点不同2）有的菌感受态因子只对同种菌起作用3.转化因子：转化因子的本质是供体DNA片段一般为线状或闭合环状；单链或双链；转化的频率往往很低，一般为0.11%。据研究，呈质粒形式（双链闭合环状）的 转化因子，其转化频率最高基因重组4.转化的检出甲（受体）strr，lys-基因重组如出现strr，lys+的菌株，则表明已经转化乙（供体）strs，lys+在含str的MM上培养转化的全过程（以噬菌体为例）基因重组（二）转导(transduction)以噬菌体为媒介，把供体细胞的DNA片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。获得新遗传性状的受体细胞，称转导子。基因重组概念：转导以温和噬菌体为媒介，其从宿主DNA上诱导裂解时可能有三种情况：1）包入的完全是噬菌体的DNA（噬菌体）2）包入的完全是细菌DNA（完全缺陷噬菌体）3）部分带有噬菌体基因的DNA（部分缺陷噬菌体）基因重组1.普遍转导（generalized transduction）1）完全转导(complete transduction)：由完全缺陷噬菌体将外源DNA片段导入受体细胞，经交换、整合、复制形成遗传性状稳定的转导子。此时受体细胞的特点：a.不发生溶源化；b.不显示免疫性；c.不会裂解产生正常噬菌体。2）流产转导(abortive transduction)：外源DNA片段不经交换、整合、复制，仅转录、转译和 性状表达。特点：子代只有一个细胞带有重组子性状。基因重组 由完全缺陷噬菌体介导的转导现象。2.局限转导：指通过部分缺陷噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并获得表达的转导现象。基因重组部分缺陷噬菌体：噬菌体带有宿主gal基因dgal噬菌体噬菌体带有宿主bio基因dbio噬菌体特点：a、无正常溶源化能力；b、受体细胞不具免疫性。根据转导频率的高低，可分为：1）低频转导（LFT）：部分缺陷噬菌体比例低，获得局限转导子量极少。2）高频转导（HFT）：双重溶源菌：感染dgal噬菌体后，又感染正 常噬菌体，且同时整合在菌染色体上。HFT裂解物：诱导裂解双重溶源菌，裂解物 中含等量的两种噬菌体，称此裂解物为。高频转导：用低感染复数的HFT裂解物感染 另一gal-受体菌时，可高频地将其转化 为gal+转导子，这种方式称3.溶源转换与转导的区别（自学）基因重组（三）接合(conjugation)供体与受体细胞直接接触，借性菌毛传递大段DNA的过程。在受体细胞中发生交换、整合，使之获得供体菌的遗传性状的现象，称为接合。通过接合而获得新性状的受体细胞就称接合子。基因重组概念：（四）原生质体融合（protoplast fusion）使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并发生遗传重组以产生融合子（fusant）的过程。基因重组 已成功地应用与植物细胞、真菌细胞、属间、科间的远缘细胞融合，融合产物含两亲代细胞基因组。过程：基因重组二、真核微生物的基因重组二、真核微生物的基因重组基因重组（一）有性杂交 一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传型后代的一种育种技术。凡是能产生有性孢子的酵母菌或霉菌，原则上都能采用与高等动、植物杂交育种相似的有性杂交方法进行育种。（二）准性杂交（parasexual hybridization）同种异株的两个体细胞融合，不经减数分裂而导致低频基因重组发生的一种繁殖方式。（单倍体体细胞重组）基因重组1.准性生殖2.准性生殖的意义：对一些没有有性过程但有重要生产价值的半知菌来说，进行基因在染色体上定性研究、杂交育种，准性生殖提供了一个重要的手段。发现存在构巢曲菌、米曲菌、青霉等真菌和放线菌中，使之有普遍意义。3.过程1）菌丝联结（anastomosis）;2）形成异核体（heterocaryon）;细胞质、核交流形成异核菌丝体。3）核配（caryogamy)形成杂合二倍体;特点：频率低，10-510-7促成：樟脑熏蒸、紫外、高温4）体细胞交换和单倍体化基因重组半知菌的准性生殖示意图基因重组异核体的特点：1）具有感受性的两种菌丝间才可形成异核体；2）具有野生型性状，可在基本培养基上生长；（基因互补功能）3）大多数异核体的分生孢子不能在基本培养基 上生长；如能生长，则为异核体、或为杂合 二倍体（重组子）。基因重组异核体：同一菌丝有不同遗传性状的核在同一 细胞质中生长。同核体：同一菌丝中只有一种核。体细胞交换和单倍体化 杂合体细胞中有极少数细胞核在进行有丝分裂的过程中，能发生体细胞染色体间的交换、分离（单倍体化）而产生具有新性状的单倍体杂合子、双倍体及非整倍体。ABA+B（同核体）（异核体）AABBABAABB（杂合二倍体）单倍体杂合子基因重组4.检出：1）若MM和CM上差别不大的，为稳定 的杂合二倍体2）若MM上不长，CM上大量长，为不 稳定异核体基因重组第四节 菌种的衰退、复壮及保藏一、菌种的衰退和复壮一、菌种的衰退和复壮1.衰退：概念：菌种经长期的人工培养或保藏，在 其自发突变的影响下，引起某些优良 性状变弱或消失的现象，称为衰退。菌种的衰退、复壮及保藏现象：菌落和细胞形态的改变；生长速度缓慢，产孢子越来越少；代谢产物生产能力或其对宿主寄生 能力下降；抵抗力、抗不良环境能力减弱等。衰退的原因：有关基因负突变1）多次传代造成负突变数量增加 如斜面保藏：细菌：1个月 酵母菌：3个月 放线菌、霉菌、芽孢：半年2）培养条件；3）诱变时出现不纯菌落。菌种的衰退、复壮及保藏2.防止衰退的方法：控制传代次数；选择合适的培养条件；采用不同类型的细胞进行传代；采用有效的菌种保藏方法。菌种的衰退、复壮及保藏3.菌种的复壮：复壮：使衰退的菌种恢复原来优 良性状的方法。复壮的方法：1）纯种分离：菌落纯（划线法、涂布法、倾注法）菌株纯（单细胞挑取法）2）通过寄主体进行复壮；3）淘汰已衰退的个体。菌种的衰退、复壮及保藏二、菌种保藏：二、菌种保藏：1.目的：存活，不丢失，不污染防止优良性状丧失随时为生产、科研提供优良菌种2.原理：创造一定条件，尽可能降低微生物代谢活动强度，使之基本上处于休眠状态。条件：1）挑选优良纯种的休眠体；2）创造适合长期休眠的环境条件（干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养、添加保护剂等）菌种的衰退、复壮及保藏3.方法：1）暂时保藏法斜面保藏方法：斜面置4冰箱保藏，定时传代原理：低温下，微生物代谢强度明显下降优点：适用于各种微生物、简便易行、易 于观察；缺点：保藏时间短、传代频、易退化、易 污染、工作量大。改良方法：橡皮塞取代棉塞、加矿油菌种的衰退、复壮及保藏2）长期保藏法方法：砂土管法 真空冷冻干燥法 液氮法原理：运用干燥、低温和隔绝空气等手段，降低 微生物菌种的新陈代谢速率，使菌种的生 命活动处于半永久性的休眠状态，以达到 长期保存的目的。菌种的衰退、复壮及保藏1 1）砂土管法：）砂土管法：干法：（适用于部分真菌、放线菌）将斜面上 孢子刮下，接种于无菌砂土管中（砂 装试管2/5)，搅拌均匀。湿法：斜面中加35ml无菌水制成菌悬液，取菌 悬液10滴加入砂土管，以管内砂全部湿 润为宜。将砂土管置于干燥器中真空干燥，低温或室温下保藏 适用于放线菌、芽孢菌和某些真菌保藏。保藏时间几至几十年。菌种的衰退、复壮及保藏2 2）真空冷冻干燥法）真空冷冻干燥法原理：加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥，使微生物细胞处于半永久的休眠状态，以达到长 久保藏的目的。方法：用无菌脱脂牛奶作保护剂，加入3ml于斜面中制成 菌悬液，分装在安瓿中速冻真空干燥。真空度维持在0.10.3mmHg,悬液维持冻结状，水分不断升华，至菌体混合物呈疏松状，熔封。优点：适用于各种微生物；便于大量保藏；可避免污染，菌种存活时间长（几到几十年）缺点：手续繁琐。菌种的衰退、复壮及保藏3)3)液氮超低温保藏法：液氮超低温保藏法：方法：用10%甘油、二甲亚砜或蔗糖和吐温80 作保护剂，将菌种分散于其中，或将长 菌的琼脂块放入保护剂中，熔封后迅速 降温至-35。预冻后保存在液氮超低温 冰箱中（-196）。优点：适用于各种微生物的较理想的保藏方法缺点：需专门设备 使用时速融，30 40水浴摇动，融后 以无菌手续开启菌种的衰退、复壮及保藏结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！80