细菌遗传课时.ppt

第七章第七章 细菌的遗传分析细菌的遗传分析一、细菌及其基因组 0.3课时二、转化重组与作图 1.0课时三、接合重组与作图 1.7课时四、性导重组与作图 0.2课时五、转导重组与作图 0.6课时六、同源重组及其机理0.2课时目目 录录一、细菌及其基因组一、细菌及其基因组1.拟核细胞(nucleoid cell)：无核膜，原核生物(prokaryotes)2.繁殖快：约20min/代，哺乳动物细胞分裂24h的1/70 3.体积小：长1-5m，宽0.5-1m；4.群体大：一支试 管可盛数百万个个体。（一）细菌细胞（一）细菌细胞(bacterium cell)1、双链环状；2、无蛋白质包装；3、成环短缩变粗。如E.coli 染色体1333m，300m成环为25m，50环后为1.5m。一、细菌及其基因组一、细菌及其基因组（二）细菌基因组（二）细菌基因组(bacterium genome)1.合成功能突变体(anabolic functional mutants)常见7种 met-thr-his-leu-pyr-(嘧啶)cyc-(胱氨酸)thi-(硫氨酸)等2.分解功能突变体(catabolic functional mutants)常见7种 lac-gal-aru-mal-xyl-(木糖)rha-(鼠李糖)pdx-(吡哆醇)等3.抗性突变体(resistant mutants)常见3种 azir strr tonr分别抗叠氮化钠,链霉素,噬菌体突变,其野生型分别为azis strs tons4.克隆形态突变(form mutants)常见2种 h,r分别为广寄主,速溶型突变,其野生型分别为h+r+5.基础代谢突变(metabolism mutants)抑制无义突变 su+野生型为su-温度敏感突变 ts 野生型为ts+(三三)细菌突变体细菌突变体(Bacterium mutants)一、细菌及其基因组一、细菌及其基因组1.重组频率高 高频重组Hfr细菌的重组率达10-22.突变率高，突变体 突变率多为10-6，变幅为10-4-10-73.易表达检测 单倍体，隐性突变易表达。基本和添加物培养基印迹法接种易鉴别。4.拟有性 细胞内有致育因子，能导致细菌间拟有性结合，能引起细菌间及细菌与病毒间遗传物质转移。(四四)细菌突变特点细菌突变特点一、细菌及其基因组一、细菌及其基因组二、转化重组（二、转化重组（transformation recombination）(一一)转化试验转化试验(transformation experiment)1.Griffith转化实验（1928），肺炎双球菌死S能表达二、二、转化转化重组重组（transformation recombination）(一一)转化试验转化试验(transformation experiment)2.Avery转化实验 (1944)16年后，Avery 死S分别添加S血清RNA酶,DNA酶和蛋白质，再分别与R混合培养。仅添加DNA酶的S性状才不表达。测定死S均为1m长约2万bp的片段。证明死S的DNA片断在没有降解时,能被R吸收并表达，称转化。S-DNA片断被R吸收、表达二、转化重组（二、转化重组（transformation recombination）(二二)转化过程与转化子转化过程与转化子(transformation)2.转化子(transformation)供体DNA片段与受体基因组整合形成的重组DNA分子。3.特点受体允许的特定区间进入；需要酶参加；氯霉素抑制酶活性可抑制DNA转化。需要能量；二硝基苯阻碍能量供应，可抑制DNA转化。转化率低。1.DNA转化过程 转化在生物界普遍存在。吸收联会交换整合表达。二、转化重组（二、转化重组（transformation recombination）(三三)转化作图（转化作图（transformanted mapping）1.Nester转化实验供体：野生型枯草杆菌，碾成 DNA片断(1m,10-6)，为什么？接合与转化的化学鉴别 A、B混合培养有wt，添加以下物质后无wt为转化DNA内切酶破坏DNA片断；氯霉素抑制DNA聚合酶活性；二硝基苯抑制能量供应，无wt时为转化，反之则反。1950，Davis，玻璃滤板(孔径10-6)，为什么？met-strs AB thr-strrA、B分别为met-strr、thr-strs时，AB混合后无菌斑，为什么？met-strr AB thr-strs三、接合重组三、接合重组(三三)大肠杆菌性别与致育因子大肠杆菌性别与致育因子(sex and fertility factor)Ex1A的thr+传给B，产生met+thr+strr野生型，有菌斑；Ex1B的met+strr同时传给A应有斑，但因频率低而无斑。即A传给B易，B传给A难，A相当于。Ex2B的met+能高频率传给A，应该有斑但无斑。说明B不 能传给A、不能作供体，相当于。推测细菌中可能有雌雄个体之分。2、性别的发现：1946，Tatum，E.coli met-strs AB thr-strrmet-strr AB thr-strsEx1Ex23.致育因子（fertility factor）大量制片观察，E.coli有2种表型：体表有鞭毛,无鞭毛；鞭毛细菌内有 1小DNA环型颗粒，6104 bp；有转移起点、致育和性鞭毛基因，称致育因子F。有F因子个体相当于，记为F+；无F因子者为，记F-F因子DNA单向复制基因单向传递，F+F-。三、接合重组三、接合重组(三三)大肠杆菌性别与致育因子大肠杆菌性别与致育因子(sex and fertility factor)三、接合重组三、接合重组(4)F因子转移步骤供体F因子引导生出性管插入孔，形成接合管 F因子滚环式DNA复制，边延伸边转移接合管断裂，雌株也有F(三三)大肠杆菌性别与致育因子大肠杆菌性别与致育因子(sex and fertility factor)三、接合重组三、接合重组(四四)低频重组与高频重组低频重组与高频重组(Lfr and Hfr)F+供体中的F因子引生性管，插入受体F-，使F-获得F因子变为 F+供体中F因子的转移频率高，但没有携带细菌基因，称低频重组(low frequency recombination,Lfr)当F因子插入细菌染色体后，细菌基因随F因子转移而转移，频率高达10-2，称高频重组(high frequency recombination，Hfr)1、低频重组与高频重组三、接合重组三、接合重组(四四)低频重组与高频重组低频重组与高频重组(Lfr and Hfr)2、F-、F+与Hfr比较 F+与F-结合 使F-变为F+；使F-长鞭毛；基因转移频率低,称LfrHfr与F-结合 F-仍为F-；F-无鞭毛；基因转移频率高，称Hfr 三、接合重组三、接合重组(五五)接合重组的特点接合重组的特点1.F-仅获得供体部分DNA，因接合管易断。2.供受体DNA片段配对，产生部分二倍体(partial diploid)，供体基因称外基因(exogenote),受体基因组称内基因(endogenote)3.内、外基因间发生偶数次交换形成有活性的重组子，奇数次交换形成线状染色体，重组子死亡。4.偶数次交换产生的重组子中一半成活，一半死亡。所以，接合重组率=重组配子数2/总配子数。三、接合重组三、接合重组(六六)中断杂交（中断杂交（the interrupted mating）与作图）与作图 1、中断杂交实验 1954，Wollman,Jacob,E.coliHfr:(aziSstrStonS)F(azirstrr tonr thr-leu-gla-lac-)第2min搅拌中断加str和thr能活者,必定为strr leu+，对leu基因记数仅加str能活者,定为strrleu+thr+，对leu和thr记数加gla+或lac+红色能消失，对gal或lac基因记数加azi或ton亡者为azis tons，对zai或ton基因记数第3min搅拌中断 直到第60min，每隔2min中断取样测定，获得各基因出现时间和数目。受体F-中出现供体基因愈早，表明离起点基因距离愈近，反之则反。定时中断性管，记录基因出现时间和数目。三、接合重组三、接合重组(六六)中断杂交与作图中断杂交与作图 2、中断杂交(interrupted mating)试验结果 重组子出现的时间顺序为基因排列顺序。即thr+leu+aziS TiSlac+gal+重组子菌落百分率随时间延长而增加，达一定频率后不再改变 基因转入愈早,菌落百分率愈高三、接合重组三、接合重组(六六)中断杂交与作图中断杂交与作图 3、基因定位（gene mapping)细菌基因从起点整合，滚环式直线转移，最先表达者离转移起点最近，基因转入的时间顺序就是基因排列顺序，时间间隔就是基因距离。E.coli染色体全长4106bp，100min转毕，相当于2000cM。所以,1min时间间隔20cM，1cM2000bp。gene|_|_|_|_|_|_|_|_|_|_|min:5 10 15 20 25 时间距离时间距离 8 11 18 25cM距离距离 160 220 360 500thr leu azi ton lac gal三、接合重组三、接合重组(六六)中断杂交与作图中断杂交与作图 4、基因精确定位 中断杂交难确定紧密连锁基因距离 中断杂交中已知lac比ade先进入F-lac+ade+与内基因间有a,b两种方式插入受体。在基本培养基上有40个斑,显然是两基因没有交换的亲型lac+ade+；在无ade的完全培养基上有10个斑,必然是两基因间交换产生的重组型lac-ade+。则重组率=lac-ade+数占总数的百分率。Rf(lac-ade)=(lac-ade+)/(lac+ade+lac-ade+)=(10)/(40+10)=20%=(lac-ade+)/ade+所以,1min时间距离20cM；lac+ade+lac-ade-lac+ade-首次转入型lac-ade+重组型基本培养40斑无ade完全10斑5、大肠杆菌染色体呈环状三、接合重组三、接合重组(六六)中断杂交与作图中断杂交与作图 Hfr菌株不同转移基因的起点及方向也不同。Hfr H是thi gallacprotonazithr逆时针方向转移；Hfr1是aziton pro lacgalthr顺时针方向转移，两菌株转移结果证明E.coli为环状染色体。thi为起点逆时针方向azi为起点顺时针方向pro为起点顺时针方向（一）性导因子（一）性导因子（F-factor）当F因子不规则环去，携带有细菌染色体片断时产生含有细菌基因的F因子，称F-factor。F因子不同，插入细菌染色体位置不同，带走细菌基因也不同。则形成的F因子也就不同。F+与Hfr 能相互转变 F因子与寄主基因组交换、整合形成Hfr，与菌株染色体成环剪切和环出会形成F+为可逆过程四、性导重组四、性导重组（sex duction recombination）1、改变受体性别 三者差异：因F 与F+均能使F-变成F+(环状DNA独立)，但Hfr不能(插入细菌基因组内)2、基因高频转移 三者差异：F与Hfr均携带细菌基因，基因随F因子高频转移；F+未携带细菌基因，F因子转移快但基因转移率低3、受体形成部分二倍体 三者差异：F与Hfr因携带的细菌基因，能与细菌基因组配对形成部分二倍体，F+却不能。（二）（二）F作用特点及与作用特点及与F+、Hfr差异比较差异比较四、性导重组四、性导重组（sex duction recombination）（三）性导（三）性导(sex duction)概念与过程概念与过程四、性导重组四、性导重组（sex duction recombination）F因子将甲物种基因转入乙物种并表达的过程。1、概念2、过程 F携带甲基因侵入乙部分二倍体内外基因间重组携带基因表达。F+携带甲基因F浸染乙物种F甲基因在乙表达将甲基因插入乙部分二倍体（三）性导（三）性导（sex duction）四、性导重组四、性导重组（sex duction recombination）作基因载体：F因子能自主复制、稳定遗传。显隐性研究：F因子进入受体后，部分二倍体中隐性基因不表达，离开受体隐性基因能表达。互补性测验：F因子进入受体后，内外基因功能不互补是同一顺反子，互补是不同的顺反子。基因作图：内外基因间重组进行基因定位。4、性导作图原理 连锁基因间距离愈近，并发转导(co-sex duction)频率愈高，反之则反。据并发转导频率进行基因定位，性导作图方法和步骤在转导作图中讲。3、性导的意义 五、转导重组与作图五、转导重组与作图（transduction recombinating and mapping）(一一)转导重组的发现及鉴定转导重组的发现及鉴定1.试验：Lederberg，1951，鼠伤寒沙门氏菌2.鉴定：U形管分开两菌株仍有wt。说明不是接合、性导重组；加二硝基苯或DNA酶后仍有wt。说明不是转化重组；P22抗性品系的LT2菌株替代LT2无wt。说明亲本LT2中有P22亲本LT2中加P22血清也无wt。证明通过滤孔的是P22质粒。P22是沙门氏菌温和型噬菌体，又称过滤因子。它能裂解LT2菌株，包装LT2基因进入LT22。以噬菌体为媒介转递基因并表达称转导重组(transduction recombination)LT22(phe-trp-tyr-his-)LT2(phe+trp+tyr+his+)混合4h后 基本培养基培养 野生型菌斑率高达10-5，为什么？DavisU形管分开双亲无野生型，不分开有野生型，说明是接合或性导重组。DavisU形管分开双亲后有野生型，可能是转导或转化重组。添加二硝基苯、氯霉素或DNA酶后无野生型产生说明是转化重组，反之为转导重组。DavisU形管分开双亲后有野生型，添加过滤因子自身血清前有野生型、添加后无野生型为转导重组。五、转导重组与作图五、转导重组与作图(二二)转导、性导、转化与接触重组的区别转导、性导、转化与接触重组的区别(三三)普遍性转导普遍性转导(general transduction)五、转导重组与作图五、转导重组与作图1、普遍性转导：phage传递供体基因组任一基因，并在受体表达2、转导过程 侵染供体降解染色体误装形成转导子释放再侵染部分二倍体转导子命运：外基因降解称丢失；外基因不复制称流产；外基因被整合，供体性状表达。普遍性：供体基因组内任一基因均有可能被转导，随机性低频性：多为310-5，该频率来由：沙门氏菌染色体约2-3千个基因，噬菌体头部能装20-30个基因，占1%；沙门氏菌中有转导能力的约0.3%。所以，基因普遍性转导频率=310-5。(三三)普遍性转导普遍性转导(general transduction)3、普遍性转导特点4、并发转导(cotransduction)2个或多个基因同时转导称为并发转导，也称共导。与性导原理一样，连锁基因间的距离愈近共导或性导率愈高，反之则反。即距离愈远的基因，愈不容易在一个短片断上共导或性导。据此，并发转导或并发性导，被广泛用于细菌基因作图。五、转导重组与作图五、转导重组与作图1、三 因子共导试验（three factor cotransduction）试验 P1 phage浸染 E.coli wt,再浸染E.coli(leu-thr-azir)(如果是F为性导)leu-thr共导成活 2%加leu+培养基成活者 加azi死 leu-azi共导 50%鉴定 thr-leu共导成活 3%加thr+培养基成活者 加azi死thr-azi共导 0%2、基因定序(基因距离近共导率高，距离远共导率低)鉴定中，leu与thr共导率低(2%)，但与zai共导率高(50%)，则leu离thr的距离比azi远。有2种排列方式：leu-azi thr 或 thrleu-azi。鉴定中，leu与azi共导率为0，则thr与azi不可能共导，所以，排序只能是thrleu-azi。(四四)普遍性转导作图普遍性转导作图（transducting mapping）五、转导重组与作图五、转导重组与作图3、基因定距离 五、转导重组与作图五、转导重组与作图重组率计算公式 两个紧密连锁基因最大并转导率为1，不能共导的两个基因并导率为0。经推导，同一染色体上两个基因之间的物理距离计算公式为：d=连锁基因间的物理距离L=转导噬菌体DNA平均长度X=两个基因的并转导率计算重组率 Rf(thr-leu)=20(噬菌体基因组长度)(1-0.0313)=13.8 Rf(thr-ai)=20(1-0.513)=4.1 4、作图thr leu azi|13.8|4.1|(四四)普遍性转导作图普遍性转导作图（transducting mapping）(五五)共导子频率作图共导子频率作图 五、转导重组与作图五、转导重组与作图 共导子与重组子频率呈正比，双交换型最少的重组子共导所产生的共导子频率也必定最小。所以，双交换最少的共导子可以确定中央基因。1、基因定序原理2、噬菌体转导试验 供体：E.coli F+（trpA+supC+pyrF+)P1 phage转导 受体：E.coli F-（trpA-supC-pyrF-）supC+标记选择 603个共导子如下。据四交换最少进行基因定序：F和C居中时与结果不符。A居中时与结果相符，则A居中央。C+F+A+C-F-A-C+F-A+114A+C+F+A-C-F-A+C-F+=03、用共导子频率定距离(五五)共导子频率与基因作图共导子频率与基因作图 五、转导重组与作图五、转导重组与作图supC trpA pyrF 7.4 12.24.作图 计算连锁基因共导率 trpA与supC：均有共导，共导率=(36+114)/603=0.25 supC与pyrF：仅 中共导，共导率=36/603=0.06。计算重组率 Rf(trpA-supC)=20(1-0.2513)=7.4 Rf(supC-pyrF)=20(1-0.0613)=12.2+（六）特殊性转导（六）特殊性转导 五、转导重组与作图五、转导重组与作图1、特殊性转导 细菌染色体特定位置导入基因。phage只能大肠杆菌的半乳糖gal与生物素bio基因中间进入。该进入位点称特定附着点(att)。2、特点：二次双链间交换重组首次双链间交换错误切割时形成转导噬菌体，正常切割时转导流产。二次双链交换，发生在att处转导子丢失，发生在gal处转导子成功。噬菌体特定位点整合正常切割，转导流产错误切割，转导噬菌体gal配对，转导子稳定att配对，转导子不稳定六、细菌同源重组及其机理六、细菌同源重组及其机理1、细菌同源重组特点 细菌同源重组有转化、接合、性导、转导。区别为转化是单链DNA片段与环状双链分子间转化，形成部分二倍体；转化仅1/2重组子，因重组始终是环状与单双链之间交换；转化总是转化重组子活，因转化频率高，称高效标记 但受体校正切除供体片段时，为低效标记。接合、性导是环状双链与单链重组，结果与转化相似。转导是双链片段与环状双链重组，需要2次双链交换才能整合。RecBCD是大肠杆菌DNA同源重组形成复合体的蛋白，有识别、切割、解旋和ATP酶活性。有3个重组亚单位：RecB、RecC与RecD协力识别chi 位点，外切骨架和解旋，使DNA产生 单股DNA末端。同源重组步骤 RecBCD识别chi 序列，并形成复合体外切骨架解旋内切chi 位点双链解离正常复制六、细菌同源重组及其机理六、细菌同源重组及其机理同源重组蛋白RecBCD识别chi引发重组2、细菌同源重组机理 RuvA.B.C是Holliday连接桥识别解离的酶系统。RuvA识别和形成交连桥，RuvB催发迁移，RuvC解离中间体。过程 RuvA识别断点形成交连桥DNA复制RuvA、B使分支迁移RuvC切除连接点。六、特殊性转导与细菌同源重组机理六、特殊性转导与细菌同源重组机理 RecA催化单链同化(自学)重组蛋白RuvA.B.C与hollidy模型2、细菌同源重组机理第第7章章 作业及复习题作业及复习题一、作业：一、作业：P180-1812.10 二、复习题二、复习题（一）名词注释（一）名词注释1.high frequency recombination 2.transformation recombination 3.sexduction recombination 4.transduction recombination 5.exogenote 6.conjugation recombination7.cotransduction（二）填空（二）填空1.a+c/+b+杂合体后代中求得并发系数=0.07，表示有（）双交换被干涉掉。2.细菌接合重组有三条途径：其一、体内含有性因子的雄株，在性因子滚环式复制的同时转移细菌基因组基因，高频率的产生基因重组。其二是性因子快速转移，但细菌基因很少转移的（），其三是携带有细菌基因的性因子发生（）。3.trp-his-tyr-受体吸收wtDAN片断后，能产生七种不同的转化子，针对 trp his二个位点的亲型有（）非亲型有（）4、用AavisU形管将a+b、ab+菌隔开后，有a+b+野生型产生。该野生型a+b+产生的途径可能是基因突变，()或()。5、性导作图原理就是依据连锁基因间距离愈近（并发转导频率）愈高，反之则反，从而进行性导基因作图。（三）选择填空（三）选择填空1、枯草杆菌供体a+b+c+与受体a-b-c-产生七种不同类型组合，针对ab位点来讲，亲型组合为()。a、+b、+-+c、-+-d、-+2、a+b、ab+菌株在DavisU形管分开后仍有a+b+产生，但加入二硝基苯后几乎不再产生，则该细菌重组途径为()。a、性导 b、转化 c、突变 d、转导3、a+b菌株用15N标记后去感染F-，短时间内中断杂交，检验DAN上标记情况时发现F-DNA上有15N标记，用该标记菌株去感染F-无法致育，则a+b菌株的类型为（）a.F+；b.F；c.Hfr；d.F-4、三组噬菌体杂交试验，获得的野生型百分率情况是：(ab+)(+c)为8.75%，(a+c)(+b+)为3.75%，(+bc)(a+)为1.25%。据双交换值最小的原理，推断abc三基因的排序为()。a、abc b、bac c、acb d、无法确定5.基因a,b是相互连锁的，其重组率为10，现在有ab+/a+b+ab/ab，则后代中的野生型比例为（）。a、10%；b、90%；c、5%；d、45%6.一个带有a+、b+、c+基因的野生型转化供体菌株和一个带有a-，b-，c-基因的突变型受体菌株，在下面几种情况中，预期哪一类转化子类型出现的频率最低？a、ab连锁而c相对不连锁；b、ac连锁b不连锁；c、三个基因的连锁顺序是a-c-b；d、三个基因的连锁顺序是c-a-b7.大肠杆菌a+b+c+d+e+且对链霉素敏感的Hfr菌株与一个基因型为a-b-c-d-e-的F-菌株杂交30分钟后用链霉素处理，再从存活的受体菌株中选出e+类型的原养型结果是a+70%，b+没有，c+85%，d+10%。问a，b，c，d基因与供体染色体的原点最近的基因为（）。a.基因a b.基因b c.基因c d.基因d8.下列细菌突变体中，（）是合成功能突变体a.st b.pyr-c.lac-d.azir（四）是非题（正确题画（四）是非题（正确题画，错误题画，错误题画）1、Hfr株的性因子从细菌染色体上环出，带有部分细胞染色体基因时形成F。()2、性导就是性因子把一个物种的基因转到另一物种中、并表达的过程。()3、三个基因连锁可能有3种线性排列顺序。（）4、F+菌株感染F-后，F-菌株仍为无法致育菌株。（）五、复习题五、复习题1、用一野生型菌株提出的DNA来转化一个不能合成丙氨酸（ala）、脯氨酸（pro）和精氨酸（arg）的突变型菌株，产生不同转化类型的菌落，其数如下：ala+pro+arg+：8400 ala+pro-arg-：840ala+pro-arg+：2100 ala+pro+arg-：1400Ala-pro+arg+：420 ala-pro+arg-：840Ala-pro-arg+：840 问（1）这些基因间的图距是多少？（2）这些基因的顺序如何？2、红色面包霉中一染色体的一个臂上有a、b、c三个基因，现a b+c得到如下子囊，试判断基因顺序，并计算所有基因间及基因一着丝粒间的距离。45 5 146 1 10 20 15 58 a b+a b+a b+a b+a b+a b+a b+a b+b c a+a b+a+c +c a b c +b+a+b c +c a b c +b+a b+a+c +c +c +c +c +c +c +c +c3、基因met和thi在红色面包霉中连锁，为定位arg，使arg+thi met，得到如下子囊孢子，试作图。arg thi met 26 arg +51arg thi +17 +thi +4arg +met 3 +met 14+thi met 56 +294、基因a,b位于同一染色体，相距20个单位，c,d同位于另一染色体，相距10个单位基因a,b同位于第三个染色体，现有纯合ABCDEF与abcdef个体杂交，产生的F1与abcdef亲本回交，则后代中如下表型的机率为多少？（1）A B C D E F (2)A B C d e f (3)A b c D E F (4)a b C d e f (5)a b c D e F