细胞融合及其应用.ppt

第第四四章章 细胞融合细胞融合及其应用及其应用第一节第一节 细胞融合概述细胞融合概述第二节第二节 细胞融合技术应用细胞融合技术应用n什么是细胞融合？什么是细胞融合？n为什么要进行细胞融合？为什么要进行细胞融合？n简述细胞融合的研究历史。简述细胞融合的研究历史。第一节第一节 细胞融合概述细胞融合概述一、细胞融合的概念和意义一、细胞融合的概念和意义1.1.概念概念 细细胞胞融融合合（cell cell fusion)fusion)又又称称体体细细胞胞杂杂交交（somatic somatic hybridization)hybridization)，即即在在自自然然条条件件下下或或用用人人工工方方法法(生生物物的的、物物理理的的、化化学学的的)使使两两个个或或两两个个以以上上的的细细胞胞合合并并形形成成一一个个细细胞胞或或使使之之分分化化再再生、形成新物种或新品种的技术。生、形成新物种或新品种的技术。v克服物种间克服物种间杂交不亲和杂交不亲和或或不能受精不能受精或或胚胎早期胚胎早期败育败育，为遗传物质广泛重组提供新途径。，为遗传物质广泛重组提供新途径。如：薯番茄、番茄薯如：薯番茄、番茄薯2.2.意义意义3.3.细胞融合的类型细胞融合的类型 n 19781978年年，德德国国科科学学家家梅梅罗罗帕帕斯斯博博士士向向世世界界宣宣告告，他他用用马马铃铃薯薯与与番番茄茄相相结结合合，得得到到了了地地上上部部分分结结青青色色果果实实的的“薯薯番番茄茄”，但但地地下下尚尚未未结结出出马马铃铃薯的块茎。薯的块茎。n后后来来，美美国国堪堪萨萨斯斯州州立立大大学学的的科科学学家家，把把番番茄茄和和马马铃铃薯薯的的细细胞胞部部分分融融合合在在一一起起，培培育育出出了了地地上上结结黄黄色色果果实实、地地下下长长白白色色薯薯块块的的“番番茄茄薯薯”，据说番茄的产量很高。，据说番茄的产量很高。v 创造细胞质杂种创造细胞质杂种 某些农艺性状如：细胞质雄性不育、某些农艺性状如：细胞质雄性不育、除草剂抗性等都是由细胞质控制的。除草剂抗性等都是由细胞质控制的。有性杂交中雄配子携带细胞质极少，有性杂交中雄配子携带细胞质极少，难以产生细胞质杂种；难以产生细胞质杂种；细胞融合的杂种细胞质能够选择某细胞融合的杂种细胞质能够选择某一亲本的叶绿体，但线粒体可实现双一亲本的叶绿体，但线粒体可实现双亲重组。亲重组。v为遗传学研究提供新的手段。为遗传学研究提供新的手段。如：核质相互关系、基因作用与定位、肿瘤的如：核质相互关系、基因作用与定位、肿瘤的发生等。发生等。二二、基本原理、基本原理v细胞融合的细胞融合的基本原理基本原理是什么？是什么？v简述简述细胞融合细胞融合的的大致过程大致过程。1.1.相关相关概念：概念：n合胞体合胞体(synkaryon)(synkaryon)：在细胞融合过程中，开始阶段只来自两个细胞的在细胞融合过程中，开始阶段只来自两个细胞的细胞质先聚集在一起，而细胞核仍保持彼此独立，这种特定阶段的细细胞质先聚集在一起，而细胞核仍保持彼此独立，这种特定阶段的细胞结构称为合胞体。胞结构称为合胞体。n同核体同核体（homokaryonhomokaryon，同核融合细胞）：基因型相同的细胞融合成的，同核融合细胞）：基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体。是由同源的原生质体融合产生的。杂交细胞称为同核体。是由同源的原生质体融合产生的。n异核体异核体（heterokaryon,heterokaryon,异核融合细胞）：来自不同基因型的细胞融合异核融合细胞）：来自不同基因型的细胞融合形成的杂交细胞为异核体。由非同源的原生质体融合产生的。形成的杂交细胞为异核体。由非同源的原生质体融合产生的。n杂种细胞（体细胞杂种）杂种细胞（体细胞杂种）：来自不同细胞核的染色体合并到一个细胞：来自不同细胞核的染色体合并到一个细胞核内，产生出杂种细胞。由于这种杂种细胞的双亲都是体细胞，因此核内，产生出杂种细胞。由于这种杂种细胞的双亲都是体细胞，因此又叫做体细胞杂种。又叫做体细胞杂种。2.2.基本原理基本原理n细胞质膜的特性细胞质膜的特性n细胞膜融合的原理细胞膜融合的原理质膜靠近，质膜靠近，质膜局部区域紧密粘连，磷质膜局部区域紧密粘连，磷脂分子重排，形成细胞桥；脂分子重排，形成细胞桥；胞质融合，胞质融合，细胞核融合。细胞核融合。3.3.细胞融合大致过程细胞融合大致过程植植物物细细胞胞融融合合过过程程人人造造小小鼠鼠培培育育过过程程示示意意图图三、细胞融合三、细胞融合方法方法v 细胞细胞融合方法融合方法有哪些？试述其原理。有哪些？试述其原理。1.11.1植物或微生物原生质体的制备植物或微生物原生质体的制备1.21.2动物单个细胞的获得动物单个细胞的获得 首首先先获获得得动动物物组组织织，然然后后经经消消化化液液消消化化获获得得单单细细胞胞。常常用用消消化化液液：胰胰蛋蛋白白酶酶适适于于细细胞胞间间质质较较少少的的软软组组织织；胶胶原原酶酶适适于于消消化化胶胶原原和和细细胞胞间间质质丰富的纤维组织、癌组织等。丰富的纤维组织、癌组织等。1.融合材料融合材料 2.融合方法融合方法诱导融合的方法种类：诱导融合的方法种类：离子诱导融合法；离子诱导融合法；l 化学诱导化学诱导 高钙高钙-高高pH法；法；PEG（聚乙二醇）法。（聚乙二醇）法。离心振荡离心振荡l 物理诱导物理诱导 显微操作显微操作 电融合电融合l 生物法生物法 仙台病毒法仙台病毒法2.1 化学法化学法2.1.1离子诱导融合法离子诱导融合法：常用的盐类离子有硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙、常用的盐类离子有硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙、氯化钙等。氯化钙等。钠离子能中和原生质体表面的负电荷，使凝钠离子能中和原生质体表面的负电荷，使凝聚的原生质体得质膜紧密接触，促进细胞融合。聚的原生质体得质膜紧密接触，促进细胞融合。（1970年，年，Power用硝酸钠使玉米和燕麦根尖细胞原生质体用硝酸钠使玉米和燕麦根尖细胞原生质体进行了融合进行了融合;1972年年,Carlson也用硝酸钠作融合剂，获得第一也用硝酸钠作融合剂，获得第一个烟草种间体细胞杂交植株。）个烟草种间体细胞杂交植株。）该方法异核体形成频率低，该方法异核体形成频率低，0.1-4%。高钙-高pH法：n首先用于人和鼠的动物细胞杂交，后来引用在植首先用于人和鼠的动物细胞杂交，后来引用在植物原生质体的融合，并利用这种融合方法获得了物原生质体的融合，并利用这种融合方法获得了烟草体细胞杂种（烟草体细胞杂种（1973年，年，50mmol/L钙离子、钙离子、pH值值10.5）。）。n钙离子浓度决定着细胞膜的稳定性和可塑性，影响原生质体膜的结钙离子浓度决定着细胞膜的稳定性和可塑性，影响原生质体膜的结合；高合；高pH值能改变质膜的表面电荷，有利于细胞融合。值能改变质膜的表面电荷，有利于细胞融合。n该方法高该方法高pH值对原生质体有害。值对原生质体有害。n异种融合效率达异种融合效率达10-35%(高国楠高国楠,1974)PEG是一种多聚化合物，分子量在是一种多聚化合物，分子量在20020000之间，毒性小易操作。之间，毒性小易操作。用用PEG法与高钙法与高钙-高高pH法结合法结合:制备两亲本制备两亲本的原生质体，并至合适密度（的原生质体，并至合适密度（105个个/ml）；将）；将PEG溶液加入，并孵育一段时间（溶液加入，并孵育一段时间（24或或37，1020分钟）；缓缓加入高钙高分钟）；缓缓加入高钙高pH溶液溶液15分分钟；洗涤，收集细胞计算融合率。钟；洗涤，收集细胞计算融合率。融合促进剂融合促进剂:伴刀豆球蛋白伴刀豆球蛋白A，二甲基亚砜和，二甲基亚砜和链胃蛋白酶等，提高细胞的融合频率。链胃蛋白酶等，提高细胞的融合频率。2.1.3 PEG（聚乙二醇）法（聚乙二醇）法nPEGPEG含有醚键而具有含有醚键而具有负极性负极性，与水、蛋白质和碳水，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团形成氢键。化合物等一些正极化基团形成氢键。当当PEGPEG分子足分子足够长时，可作为邻近原生质体表面之间的分子桥够长时，可作为邻近原生质体表面之间的分子桥而使之粘连。而使之粘连。nPEGPEG也也能连接能连接Ca2+Ca2+等阳离子等阳离子。Ca2+Ca2+可在一些负极化可在一些负极化基团和基团和PEGPEG之间形成桥，因而促进粘连之间形成桥，因而促进粘连;n在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEGPEG分子可分子可被洗脱，引起电荷的紊乱和再分布，从而引起原被洗脱，引起电荷的紊乱和再分布，从而引起原生质体融合生质体融合;n高高Ca2+Ca2+高高pHpH清洗增加了质膜的流动性，大大提高清洗增加了质膜的流动性，大大提高了融合频率。了融合频率。PEG诱导融合原理诱导融合原理蟾蜍血细胞融合实验蟾蜍血细胞融合实验蟾蜍血细胞融合实验蟾蜍血细胞融合实验 物理诱导融合包括物理诱导融合包括离心振荡、显微操作和电离心振荡、显微操作和电融合融合 显微操作显微操作：显微操作将大熊猫体细胞注入去：显微操作将大熊猫体细胞注入去核兔卵母细胞卵周隙中。核兔卵母细胞卵周隙中。2.2 物理诱导融合物理诱导融合 电融合电融合 原理：原理：细胞处于不均一的细胞处于不均一的交变电场交变电场，细胞极化，细胞极化成为偶极子，排列成串珠状，再施加成为偶极子，排列成串珠状，再施加瞬间强脉冲瞬间强脉冲使质膜发生可逆性电击穿，从而导致融合。使质膜发生可逆性电击穿，从而导致融合。在融合仪控制下的融合小室内进行。各种指标在融合仪控制下的融合小室内进行。各种指标都可精细调节控制，融合效率高都可精细调节控制，融合效率高（zimmermann1981,融合频率达融合频率达60%）。优点：优点：融合效率高、操作简单、重复性强、无融合效率高、操作简单、重复性强、无毒性、可在显微镜下直接观察细胞融合过程。毒性、可在显微镜下直接观察细胞融合过程。n仙台病毒：仙台病毒：亦称亦称HVJHVJ（Hemagglutinating virus of Hemagglutinating virus of JapJapanan的缩写），乙型副流感病毒。属副黏液病毒的缩写），乙型副流感病毒。属副黏液病毒属，属，RNARNA病毒。（病毒。（M MKuroyaKuroya），（），（19531953）。）。n年，日本大阪大学微生物研究所的岗田善雄年，日本大阪大学微生物研究所的岗田善雄首次发现仙台病毒能使相邻细胞粘在一起，并首次发现仙台病毒能使相邻细胞粘在一起，并使膜产使膜产生一些断裂生一些断裂，两个细胞核会通过裂口融合在一起；，两个细胞核会通过裂口融合在一起；n不耐热，几乎可不耐热，几乎可凝集所有种类的红血球凝集所有种类的红血球，而且有溶血，而且有溶血性。在鸡胚、各种动物肾脏培养细胞的细胞质中增殖。性。在鸡胚、各种动物肾脏培养细胞的细胞质中增殖。2.3 生物法生物法病毒法病毒法 疱疹病毒、牛痘病毒和副黏液病毒疱疹病毒、牛痘病毒和副黏液病毒n病毒囊膜上有许多刺突（病毒囊膜上有许多刺突（spike)，刺突上都是一，刺突上都是一个单价血细胞凝集素；个单价血细胞凝集素；n刺突还有唾液酸苷酶的活性，水解寡糖链上的唾刺突还有唾液酸苷酶的活性，水解寡糖链上的唾液酸残基，攻击细胞表面。液酸残基，攻击细胞表面。紫外线紫外线丧失感染活性丧失感染活性（不感染细胞）（不感染细胞）保留融合活性保留融合活性（诱导细胞融合）（诱导细胞融合）仙台病毒仙台病毒程序：程序：紫外线将病毒灭活，稀紫外线将病毒灭活，稀释到一定浓度，加入到释到一定浓度，加入到细胞悬液中，离心，诱细胞悬液中，离心，诱导细胞融合。导细胞融合。优点：优点：融合效率高，适合于各种动物细胞；融合效率高，适合于各种动物细胞；仙台病毒在鸡胚中大量繁殖，容易培仙台病毒在鸡胚中大量繁殖，容易培养。养。缺点缺点:仙台病毒不稳定，制备过程繁琐，易仙台病毒不稳定，制备过程繁琐，易失活，容易对细胞产生干扰；失活，容易对细胞产生干扰；3.13.1植物细胞融合植物细胞融合：植物原生质体融合植物原生质体融合无种属特异性无种属特异性，融合效率只与外界条，融合效率只与外界条件有关。件有关。nPEGPEG诱导关键是处理时间，过长损伤原生质体，过短不融合；诱导关键是处理时间，过长损伤原生质体，过短不融合；PEGPEG的规格和纯度，分子量多为的规格和纯度，分子量多为4000400060006000。n电融合，与原生质体密度有关，最适密度为电融合，与原生质体密度有关，最适密度为2102104 48 8 10104 4n电融合时，加入少量电融合时，加入少量CaClCaCl2 2,可维持电导率，保护细胞；交可维持电导率，保护细胞；交变电流强弱、处理时间长短及电脉冲的大小影响融合率。变电流强弱、处理时间长短及电脉冲的大小影响融合率。n添加促融合剂，可提高融合率。添加促融合剂，可提高融合率。3.影响融合的因素影响融合的因素3.23.2 动物细胞融合动物细胞融合n亲本细胞表面性质影响大：表面覆盖绒毛且不规则的较容亲本细胞表面性质影响大：表面覆盖绒毛且不规则的较容易；表面光滑的不易融合；易；表面光滑的不易融合；n细胞种类不同，融合效果不同：腹水癌细胞易融合，淋巴细胞种类不同，融合效果不同：腹水癌细胞易融合，淋巴细胞或血球细胞不易融合。细胞或血球细胞不易融合。n融合时温度和运动状态：仙台病毒诱导腹水癌细胞融合，融合时温度和运动状态：仙台病毒诱导腹水癌细胞融合，3737度、振荡。度、振荡。n需氧量大，缺氧常不融合。需氧量大，缺氧常不融合。n需要需要Ca Ca 2+2+，最适浓度为，最适浓度为0.1mol/L0.1mol/L。n最适最适pHpH值为值为7.47.47.87.8。四、杂种细胞的筛选和鉴定四、杂种细胞的筛选和鉴定（一）体细胞杂种的遗传特性（一）体细胞杂种的遗传特性 1 1、细胞分裂与染色体丢失、细胞分裂与染色体丢失如如果果细细胞胞分分裂裂而而核核不不发发生生融融合合，在在以以后后的的发发育育过过程程中中就就会会有有两两种种结结果果，一一是是细细胞胞分分裂裂几几次次以以后后即即停停止止生生长长从从而而导导致致死死亡亡；二二是是在在发发育育过过程程中中某某一一亲亲本本的的细细胞胞核核部部分分或或全全部部丢丢失失。如如果果这这样样就就会会产产生生几几种种情情况况：A A细细胞胞B B细细胞胞质质；A A细细胞胞B B细胞质和部分染色体或基因。细胞质和部分染色体或基因。2 2、基因转移与性状表达、基因转移与性状表达由由于于染染色色体体的的部部分分丢丢失失，常常常常使使某某个个亲亲本本的的部部分分或或个个别别基基因因与与另另一一亲亲本本的的染染色色体体发发生生整整合合，其其结结果果是是实实现现了了亲亲本本间间的的基基因因转转移移。基基因因转转移移通通常常是是在在后后代代中中某某些些性性状状得得以以表表达达，有有时时由由于于基因的重组也可能产生双亲均没有的新性状。基因的重组也可能产生双亲均没有的新性状。3 3、体细胞杂种遗传上的不稳定性、体细胞杂种遗传上的不稳定性体细胞杂种后代在遗传上常常不稳定，这可能涉体细胞杂种后代在遗传上常常不稳定，这可能涉及到多方面的因素，如亲缘关系的远近、培养过及到多方面的因素，如亲缘关系的远近、培养过程中的染色体变异、细胞核、细胞质遗传物质的程中的染色体变异、细胞核、细胞质遗传物质的重组等。重组等。（二）融合细胞的筛选（二）融合细胞的筛选I I、植物细胞筛选方式、植物细胞筛选方式1 1、遗遗传传互互补补筛筛选选法法：利利用用每每一一亲亲本本贡贡献献一一个个功功能能正正常常等等位位基基因因，纠纠正正另另一一亲亲本本的的缺缺陷陷，令令杂杂种种细细胞表现正常。胞表现正常。如：如：亲本亲本1 1：叶绿体缺陷型：叶绿体缺陷型 亲本亲本2 2：光致死型：光致死型 两两亲亲本本在在光光照照下下一一种种死死亡亡，另另一一种种呈呈白白色色，融合细胞长成植株呈绿色，并能成长。融合细胞长成植株呈绿色，并能成长。（2 2）抗抗性性互互补补筛筛选选法法：利利用用亲亲本本细细胞胞原原生生质质体体对对抗抗生生素素、除除草草剂剂及及其其它它有有毒毒物物质质抗抗性性差差异异选选择择杂种细胞。杂种细胞。亲亲本本1 1：对对放放线线菌菌素素D D抗抗性性，但但在在MSMS培培养养基基上上不不能超过能超过5050个世代；个世代；亲本亲本2 2：对放线菌素：对放线菌素D D很敏感，但能在很敏感，但能在MSMS上生长；上生长；杂杂种种细细胞胞能能在在含含有有放放线线菌菌素素的的MSMS培培养养基基上上生生长长，而亲本和其它细胞死亡。而亲本和其它细胞死亡。3 3）利用物理特性筛选法）利用物理特性筛选法：根根据据亲亲本本的的原原生生质质体体大大小小、颜颜色色、漂漂浮浮密密度度及及电电泳迁移率、形成的愈伤组织的差异筛选杂种细胞。泳迁移率、形成的愈伤组织的差异筛选杂种细胞。如：如：亲本亲本1 1：异硫氰酸荧光素（：异硫氰酸荧光素（FITCFITC）标记）标记 亲本亲本2 2：碱性蕊香红荧光素标记：碱性蕊香红荧光素标记 在在荧荧光光显显微微镜镜下下，亲亲本本1 1为为绿绿色色，亲亲本本2 2为为红红色色，杂种细胞可以区分杂种细胞可以区分4 4）利用生长特性筛选法：）利用生长特性筛选法：利利用用原原生生质质体体对对培培养养基基成成分分要要求求与与反反应应的的差差异异选选择杂种细胞。择杂种细胞。例例如如粉粉兰兰烟烟草草与与朗朗氏氏烟烟草草细细胞胞原原生生质质体体均均需需外外源源激激素素才才能能生生长长，但但其其融融合合细细胞胞可可以以产产生生内内源源激激素素，在培养基上不需加激素。在培养基上不需加激素。i.i.IIII、动物细胞筛选方式动物细胞筛选方式1 1、利利用用抗抗药药性性筛筛选选系系统统：利利用用生生物物细细胞胞对对药药物物敏敏感性差异筛选杂种细胞。感性差异筛选杂种细胞。n亲本亲本A A：对氨苄青霉素敏感，对卡娜霉素不敏感：对氨苄青霉素敏感，对卡娜霉素不敏感n亲本亲本B B：对卡娜霉素敏感，对氨苄青霉素不敏感：对卡娜霉素敏感，对氨苄青霉素不敏感n杂种细胞可以在含有两种抗生素的培养基上生长杂种细胞可以在含有两种抗生素的培养基上生长2 2、营营养养互互补补筛筛选选系系统统：细细胞胞在在缺缺乏乏一一种种或或几几种种营营养养成成分分时时，不不能能生生长长繁繁殖殖，即即营营养养缺缺陷陷型型细细胞胞。利利用用两两种种亲亲本本细细胞胞营营养养互互补补作作用用原原理理可可以以筛筛选选杂杂种种细胞。细胞。n亲本亲本A A：色氨酸缺陷型：色氨酸缺陷型n亲本亲本B B：苏氨酸缺陷型：苏氨酸缺陷型n杂杂种种细细胞胞可可以以在在不不含含色色氨氨酸酸和和苏苏氨氨酸酸的的培培养养基基上上培养，而亲本细胞均会死亡。培养，而亲本细胞均会死亡。3 3、温温度度敏敏感感突突变变型型杂杂种种细细胞胞的的筛筛选选：一一般般的的培培养养细细胞胞能能在在3232度度到到4040度度的的范范围围内内生生长长，但但温温度度敏敏感感突突变变型型的的细细胞胞能能在在高高温温或或低低温温下下生生长长。由由此此筛筛选选杂种细胞。杂种细胞。n亲亲本本一一：具具有有卡卡那那霉霉素素抗抗性性但但只只能能在在3737度度左左右右生生长。长。n亲本二：高温敏感突变型，但不能抗卡娜霉素。亲本二：高温敏感突变型，但不能抗卡娜霉素。n杂种细胞能在高温和含卡娜霉素的培养基上生长。杂种细胞能在高温和含卡娜霉素的培养基上生长。第二节第二节 细胞融合技术应用细胞融合技术应用一、动物细胞融合和单克隆抗体制备一、动物细胞融合和单克隆抗体制备（一）动物细胞融合研究（一）动物细胞融合研究简史简史（二）动物细胞融合技术主要（二）动物细胞融合技术主要应用应用（三）（三）单克隆抗体制备单克隆抗体制备二、植物原生质体融合培育新品种二、植物原生质体融合培育新品种（一）研究简史（一）研究简史（二）融合程序（二）融合程序三、微生物原生质体融合构建新菌株三、微生物原生质体融合构建新菌株一、动物细胞融合和单克隆抗体制备一、动物细胞融合和单克隆抗体制备（一）动物细胞融合研究简史（一）动物细胞融合研究简史 生物界自发细胞融合：生物界自发细胞融合：18381838年，年，MullerMuller发现分散性肿瘤细胞能自发融发现分散性肿瘤细胞能自发融合产生多核细胞。后来人们发现了多种体内细合产生多核细胞。后来人们发现了多种体内细胞合并现象。胞合并现象。体外培养细胞融合：体外培养细胞融合：v19581958年年，日日本本人人冈冈田田发发现现仙仙台台病病毒毒具具有有诱诱发发艾艾氏癌细胞相互融合的效应。氏癌细胞相互融合的效应。v13651365年年，冈冈田田等等利利用用仙仙台台病病毒毒诱诱导导两两种种不不同同动动物细胞融合，产生第一个种间异核体。物细胞融合，产生第一个种间异核体。v19781978年年，瑞瑞士士科科学学家家和和美美国国科科学学家家将将人人的的纤纤维维肉肉瘤瘤细细胞胞与与小小鼠鼠的的畸畸胎胎瘤瘤细细胞胞融融合合，获获得得含含人人体染色体的小鼠。体染色体的小鼠。人畜细胞融合引发激烈争论 20002000年年1010月月，澳澳大大利利亚亚和和美美国国的的两两家家生生物物公公司司把把人人体体细细胞胞和和猪猪细细胞胞融融合合在在一一起起，并并向向欧欧洲洲专专利利局局申申请请专专利利。环环保保人人士士指指责责这这些些科科学学家家是是“弗弗兰兰肯肯斯斯坦坦式式的的科科学学家家”-创创造造怪怪物物的的人人最最终终受受到到怪怪物物的的伤伤害害 ，所所造造出出的的是是令令人人恐恐惧惧的的“半人半猪怪物半人半猪怪物”。目目前前，融融合合技技术术已已迅迅速速发发展展到到动动物物间间、动动植植物物间间及及人人体体细细胞胞和和动动植物细胞间。植物细胞间。狮头、羊身、蛇狮头、羊身、蛇尾的吐火怪兽尾的吐火怪兽（二）（二）动物细胞融合技术主要应用动物细胞融合技术主要应用1 1、染色体、染色体的基因定位的基因定位 如如：将将人人体体细细胞胞与与小小鼠鼠细细胞胞融融合合，在在杂杂种种细细胞胞系系中中，优优先先排排斥斥人人染染色色体体，因因此此，每每种种细细胞胞系系都都仅仅含含有有一条或若干条特异性的人染色体。一条或若干条特异性的人染色体。通通过过对对这这些些细细胞胞系系生生理理生生化化功功能能分分析析，就就可可以以断断定特定的人染色体的功能。定特定的人染色体的功能。已已经经证证明明，仅仅保保留留着着1 1号号人人染染色色体体的的人人-小小鼠鼠杂杂种种细细胞胞系系，才才能能合合成成人人尿尿苷苷单单磷磷酸酸激激酶酶，证证实实编编码码这这种种激酶的人基因定位在激酶的人基因定位在1 1号染色体号染色体上上。将将不不同同人人类类疾疾病病遗遗传传缺缺陷陷的的突突变变细细胞胞融融合合，产产生生的的杂杂种种细细胞胞由由于于基基因因的的互互补补作作用用，可可恢恢复复其其正正常常的的表型。表型。应应用用基基因因互互补补分分析析，断断定定突突变变体体所所涉涉及及的的基基因因数数目目，分分析析基基因因的的结结构构，剖剖析析遗遗传传疾疾病病的的病病因因:杂杂种种细细胞测定胞测定 不不互补，缺失同一基因或同一基因产生同样突变；互补，缺失同一基因或同一基因产生同样突变；互补，缺失不同基因或同一基因不同部位发生突变互补，缺失不同基因或同一基因不同部位发生突变。2 2、遗传疾病的治疗与基因互补分析遗传疾病的治疗与基因互补分析3 3、制备、制备单克隆抗体单克隆抗体1 1、什么是单克隆抗体？、什么是单克隆抗体？v 回顾抗体基础知识回顾抗体基础知识 抗体的化学本质是什么？抗体的化学本质是什么？抗体由何种细胞产生？抗体由何种细胞产生？用传统的方法如何获得抗体？用传统的方法如何获得抗体？思考思考？（三）单克隆抗体技术（三）单克隆抗体技术抗体：能够与抗原发生特异性结合的免疫球蛋抗体：能够与抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。白。能产生抗体的细胞是浆细胞（即效应能产生抗体的细胞是浆细胞（即效应B B细胞）。细胞）。抗体的传统生产方法抗体的传统生产方法抗原抗原 反复注射动物反复注射动物血清中分离抗体血清中分离抗体该法制备抗体的缺点：该法制备抗体的缺点：产量低、纯度低，且抗体的产量低、纯度低，且抗体的特异性差、灵敏度低。特异性差、灵敏度低。所有抗所有抗体体混合混合人人们们发发现现，在在动动物物发发生生免免疫疫反反应应的的过过程程中中，体体内内的的B B细细胞胞可可以以产产生生多多达达百百万万种种以以上上的的特特异异性性抗抗体体，而而每每个个B B细细胞胞只只分分泌泌一一种种化化学学性性质质单单一一、特特异异性性强强的的抗体。抗体。要要想想获获得得大大量量的的单单一一抗抗体体，必必须须用用单单个个B B细细胞胞进进行行无性繁殖，即克隆。无性繁殖，即克隆。n单克隆单克隆抗体：单个抗体：单个B B细胞克隆产生的化学性质单细胞克隆产生的化学性质单一、特异性强的抗体。一、特异性强的抗体。提示提示1 1：B B细胞可以进行无限增殖吗？细胞可以进行无限增殖吗？提示提示2 2：我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的：我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的？问题：如何大量生产单克隆抗体？请尝试设计一个问题：如何大量生产单克隆抗体？请尝试设计一个方案。方案。一个一个B B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体淋巴细胞只分泌一种特异性抗体 骨髓瘤细胞能无限增殖骨髓瘤细胞能无限增殖杂交瘤细胞杂交瘤细胞动物细胞培养技术动物细胞培养技术设计方案：设计方案：动物细胞融合技术动物细胞融合技术单克隆抗体单克隆抗体既能产生特异性抗体，既能产生特异性抗体，又能大量增又能大量增殖的细胞殖的细胞1975197519751975年科学家年科学家年科学家年科学家米尔斯坦米尔斯坦和和和和柯勒柯勒的实验的实验的实验的实验BBBB 、B B瘤瘤 、瘤瘤瘤瘤 （B B、瘤）、瘤）（一选）（一选）选择选择性培养基性培养基：只：只有有杂交瘤细胞杂交瘤细胞才能存活才能存活获得产生相应抗获得产生相应抗体的体的B B细胞细胞（二选）：选能（二选）：选能产生所需产生所需专一抗专一抗体的杂交瘤细胞体的杂交瘤细胞体外培养体外培养体外培养体外培养小鼠腹腔内培养小鼠腹腔内培养小鼠腹腔内培养小鼠腹腔内培养2 2、制备单克、制备单克隆抗体流程隆抗体流程（1 1）动物免疫与免疫脾细胞制备）动物免疫与免疫脾细胞制备（2 2）骨髓瘤突变缺陷细胞株的培养和选择）骨髓瘤突变缺陷细胞株的培养和选择（3 3）细胞融合：淋巴细胞杂交瘤的制备细胞融合：淋巴细胞杂交瘤的制备 （4 4）杂交瘤细胞的筛选杂交瘤细胞的筛选（5 5）特异性杂交瘤细胞的筛选特异性杂交瘤细胞的筛选（6 6）杂交瘤细胞克隆化培养和冻存杂交瘤细胞克隆化培养和冻存（7 7）McABMcAB的大量制备的大量制备（8 8）单克隆抗体的鉴定单克隆抗体的鉴定3 3、制备单克隆抗体的基本技术、制备单克隆抗体的基本技术文献解读文献解读u免免疫疫的的目目的的是是产产生生足足够够多多的的能能识识别别目目的的抗抗原原的的B B淋淋巴细胞。巴细胞。（1 1）动物免疫与免疫脾细胞制备）动物免疫与免疫脾细胞制备文献解读文献解读（2 2）骨髓瘤细胞的培养和选择）骨髓瘤细胞的培养和选择n骨骨髓髓瘤瘤细细胞胞：一一般般不不分分泌泌抗抗体体，能能在在体体外外无无限限繁繁殖殖和和连连续续继继代代培培养养，且且为为HGPRT-HGPRT-（次次黄黄嘌嘌呤呤鸟鸟嘌嘌呤呤磷磷酸酸核核糖糖转转移移酶酶）或或TK-TK-（胸胸腺腺嘧嘧啶啶核核苷激酶）。苷激酶）。n培培养养可可采采用用一一般般的的动动物物细细胞胞培培养养液液，小小牛牛血血清清的浓度一般在的浓度一般在10%-20%10%-20%。n细细胞胞融融合合前前必必须须做做骨骨髓髓瘤瘤细细胞胞对对HATHAT选选择择培培养养基基敏感性实验，不敏感的细胞不能用于细胞融合。敏感性实验，不敏感的细胞不能用于细胞融合。n什么是什么是HATHAT选择培养基选择培养基/HATHAT选择系统选择系统？nHATHAT是是含含一一定定浓浓度度次次黄黄嘌嘌呤呤（H H）、氨氨基基喋喋呤呤（A A）及及胸胸腺腺嘧嘧啶啶核核苷苷（T T）的的一一种种选选择择性性培培养养基基，其其中中三种成分与细胞三种成分与细胞DNADNA合成有关。合成有关。nDNADNA合成途径有两种：合成途径有两种：HATHAT选择系统选择系统nB B淋淋巴巴细细胞胞具具有有HGPRTHGPRT、TKTK这这两两种种酶酶,因因此此在在DNADNA合合成成正正常常途途径径被被阻阻断断后后，仍仍能能利利用用HATHAT培培养养基基中中的的次次黄黄嘌嘌呤呤和和胸胸腺腺嘧嘧啶啶来来合合成成DNA,DNA,可可在在HATHAT培培养养基基中中存存活活；但但B B淋淋巴巴细细胞胞是是正正常常细细胞胞,不不能能长长期期存活。存活。n杂杂交交瘤瘤细细胞胞具具有有双双亲亲的的遗遗传传特特性性，具具有有来来自自于于淋淋巴巴细细胞胞的的HGPRTHGPRT和和TK,TK,可可以以采采用用补补救救途途径径合合成成DNADNA，因此可在，因此可在HATHAT培养基中存活与繁殖。培养基中存活与繁殖。（3 3）细胞融合细胞融合：淋巴细胞杂交瘤的制备：淋巴细胞杂交瘤的制备 nPEGPEG法诱导细胞融合流程：法诱导细胞融合流程：n将将免免疫疫脾脾细细胞胞和和小小鼠鼠骨骨髓髓细细胞胞以以2 2：1 1或或1010：1 1的的比比例例混混匀匀于于50ml50ml锥锥形形离离心心管管内内，1200rpm1200rpm离离心心7 71010分分钟钟，尽尽量量吸吸净净上上清清液液，用用手手指指轻轻击击管管壁壁，使使管管底底沉沉淀淀的的细细胞胞铺铺展展成成薄薄层层，在在室室温温条条件件下下边边轻轻轻轻振振摇摇离离心心管管边边在在6060秒秒钟钟内内逐逐滴滴加加入入50%50%的的PEG PEG 0.5ml0.5ml，随随后后静静置置9090秒秒，再再于于5 5分分钟钟内内边边振振摇摇边边逐逐滴滴加加入入5 510ml10ml不不含含血血清清的的培培液液或或盐盐水水缓缓冲冲液液，以终止以终止PEGPEG的作用，再静置的作用，再静置1010分钟。分钟。（4 4）HATHAT培养基筛选培养基筛选杂交瘤细胞杂交瘤细胞n悬悬浮浮于于HATHAT培培养养液液中中培培养养，每每隔隔3 34 4天天半半量量更更换换HATHAT培培养养液液，1515天天后后改改用用HTHT培培养养基基，3 3周周后后改改用用完完全全RPMI1640RPMI1640培培养养液液，培培养养8-128-12天天进进行行抗体检测。抗体检测。（5 5）特异性特异性杂交瘤细胞的筛选杂交瘤细胞的筛选n通通过过选选择择性性培培养养后后生生长长的的杂杂交交瘤瘤细细胞胞，仅仅有有部部分分是是分分泌泌预预定定特特异异性性抗抗体体的的杂杂交交瘤瘤细细胞胞。可可取取上上清清液液，根根据据抗抗原原的的性性质质、抗抗体体类类型型及及所所需需灵灵敏敏度度等等具体情况来加以选择。具体情况来加以选择。n可可溶溶性性抗抗原原可可采采用用放放射射免免疫疫、免免疫疫酶酶标标测测定定、间间接血凝等方法测定。接血凝等方法测定。n细细胞胞抗抗原原可可采采用用免免疫疫荧荧光光、溶溶血血空空斑斑测测定定等等方方法法直接测定针对这些抗原的抗体。直接测定针对这些抗原的抗体。（6 6）杂交瘤细胞克隆化培养和冻存）杂交瘤细胞克隆化培养和冻存n利利用用单单个个细细胞胞培培养养技技术术选选育育出出遗遗传传稳稳定定的的分分泌泌特特异抗体的细胞系。异抗体的细胞系。n在在培培养养过过程程中中，一一般般要要加加能能释释放放某某些些生生长长因因子子促促进进杂杂交交瘤瘤生生长长的的饲饲养养细细胞胞，如如小小鼠鼠的的腹腹腔腔巨巨噬噬细细胞、脾细胞或胸腺细胞等胞、脾细胞或胸腺细胞等。n方方法法有有有有限限稀稀释释法法、软软琼琼脂脂培培养养法法、显显微微操操作作法法、应用荧光激活分选仪应用荧光激活分选仪等。等。n阳阳性性杂杂交交瘤瘤细细胞胞应应及及时时冻冻存存，防防染染色色体体丢丢失失、变变异及污染。异及污染。文献解读文献解读文献解读文献解读文献解读文献解读（7 7）McABMcAB的大量制备的大量制备文献解读文献解读（8 8）单克隆抗体的鉴定）单克隆抗体的鉴定文献解读文献解读 4 4、单克隆抗体的应用、单克隆抗体的应用 4.14.1 病毒性疾病的诊断和治疗：病毒性疾病的诊断和治疗：可可检检测测多多种种病病毒毒中中非非常常细细微微的的株株间间差差异异，鉴鉴定定细细菌菌的的种种型型和和亚亚种种。诊诊断断异异常常准准确确，误误诊诊率率大大降低。大大降低。例例如如，抗抗乙乙型型肝肝炎炎病病毒毒表表面面抗抗原原（HBsAgHBsAg）的的单单克克隆隆抗抗体体，灵灵敏敏度度比比当当前前最最佳佳的的抗抗血血清清还还要要高高100100倍，能检测出抗血清的倍，能检测出抗血清的6060的假阴性。的假阴性。4.24.2 癌症治疗癌症治疗 可可检检查查出出尚尚无无临临床床表表现现的的极极小小肿肿瘤瘤病病灶灶，检检测测心肌梗死的部位和面积。心肌梗死的部位和面积。人人们们正正在在研研究究“生生物物导导弹弹”单单克克隆隆抗抗体体作作载载体体携携带带药药物物，使使药药物物准准确确地地到到达达癌癌细细胞胞，以以避避免免化化疗疗或或放放射射疗疗法法把把正正常常细细胞胞与与癌癌细细胞胞一一同同杀杀死死的的副副作作用用。在在人人体体扫扫描描图图技技术术和和肿肿瘤瘤定定位位方面已获得很大进展。方面已获得很大进展。4.34.3 生产免疫避孕药生产免疫避孕药 可精确地检测排卵期，将早期胚胎来制备单克隆可精确地检测排卵期，将早期胚胎来制备单克隆抗体。抗体。新一代免疫避孕药就是用精子，卵透明带或早期新一代免疫避孕药就是用精子，卵透明带或早期胚胎来制备单克隆抗体，将它们注入妇女体内，胚胎来制备单克隆抗体，将它们注入妇女体内，人体就会产生对精子的免疫反应，从而起到避孕人体就会产生对精子的免疫反应，从而起到避孕作用。作用。4.44.4 生产生物药品生产生物药品生生物物药药品品主主要要有有各各种种疫疫苗苗、菌菌苗苗、抗抗生生素素、生生物物活活性性物物质质、抗抗体体等等，是是生生物物体体内内代代谢谢的的中中间间产产物物或分泌物。或分泌物。过过去去制制备备疫疫苗苗是是从从动动物物组组织织中中提提取取，得得到到的的产产量量低低而而且且很很费费时时。现现在在，利利用用细细胞胞工工程程或或细细胞胞融融合合途途径径，大大大大提提高高了了效效率率，还还能能制制备备出出多多价价菌菌苗苗，可同时抵御两种以上的病原菌的侵害。可同时抵御两种以上的病原菌的侵害。4.54.5 免疫学研究免疫学研究 鉴定、区分各种抗原检测抗原上的决定簇；鉴定、区分各种抗原检测抗原上的决定簇；对抗体的基因定位及表达进行研究。对抗体的基因定位及表达进行研究。4.64.6 大分子蛋白的提纯大分子蛋白的提纯 将将抗抗体体交交联联到到溴溴化化氢氢活活化化的的琼琼脂脂糖糖基基质质上上，制制成成免免疫疫亲亲和和层层析析柱柱。提提纯纯得得到到的的蛋蛋白白质质杂杂质含量低，对产物起始浓度要求低。质含量低，对产物起始浓度要求低。二、植物原生质体融合培育新品种二、植物原生质体融合培育新品种1.1.研究简史研究简史n19721972年年美美国国的的CarlsonCarlson使使粉粉兰兰烟烟草草与与郎郎氏氏烟烟草草的的细胞融合，细胞融合，获得烟草种间杂种植物；获得烟草种间杂种植物；n19771977年年后后，中中国国农农业业科科学学院院烟烟草草研研究究所所的的科科研研人人员员，用用普普通通烟烟草草和和黄黄花花烟烟草草的的体体细细胞胞进进行行融融合合，培培育出两批烟草杂种植株，并开花结实。育出两批烟草杂种植株，并开花结实。n19781978年年德德国国的的梅梅歇歇尔尔斯斯首首次次将将番番茄茄和和马马铃铃薯薯细细胞胞融合成功，称之为融合成功，称之为“pomoto”pomoto”。科间体细胞杂交再生植株的仅有几例科间体细胞杂交再生植株的仅有几例:胡萝卜胡萝卜(+)(+)烟草，胡萝卜烟草，胡萝卜(+)(+)水稻，胡萝卜水稻，胡萝卜(+)(+)大麦大麦,其其中胡萝卜中胡萝卜(+)(+)烟草获得可育杂种植株。烟草获得可育杂种植株。但在