生物质谱法幻灯片.ppt

生物质谱法第1页，共30页，编辑于2022年，星期一第2页，共30页，编辑于2022年，星期一主要作用：主要作用：确定化合物准确的分子式（分子量）确定化合物准确的分子式（分子量）提供某些一级结构信息提供某些一级结构信息一级一级构造构造二级二级构型构型三级三级构象构象第3页，共30页，编辑于2022年，星期一一、质谱计一、质谱计三个功能：三个功能：1）使挥发性不同的化合物气化）使挥发性不同的化合物气化2）把气化的分子电离）把气化的分子电离3）将形成的离子按质）将形成的离子按质-荷比（荷比（m/z）分离，）分离，随后检出并记录随后检出并记录构成：构成：真空系统，进样系统，离子源，质量分析器，真空系统，进样系统，离子源，质量分析器，离子检测器，记录器离子检测器，记录器第4页，共30页，编辑于2022年，星期一高真空系统：为了避免离子与气体分子的碰撞高真空系统：为了避免离子与气体分子的碰撞进样系统：在不破坏真空的情况下，固体和沸进样系统：在不破坏真空的情况下，固体和沸点较高的液体样品可通过进样推杆送入离子源点较高的液体样品可通过进样推杆送入离子源并在其中加热汽化，低沸点样品在贮气器中汽化后进并在其中加热汽化，低沸点样品在贮气器中汽化后进入离子源，气体样品可经贮气器进入离子源。入离子源，气体样品可经贮气器进入离子源。离子源：是样品分子的离子化场所。离子源：是样品分子的离子化场所。第5页，共30页，编辑于2022年，星期一二、离子化的方法二、离子化的方法1、电子轰击（、电子轰击（electron impact,EI)第6页，共30页，编辑于2022年，星期一 EI EI 谱的谱的 优点优点:断裂广泛断裂广泛,产生的碎片离子模式有助于鉴定。产生的碎片离子模式有助于鉴定。缺点缺点:分子离子峰丰度低分子离子峰丰度低 第7页，共30页，编辑于2022年，星期一2 2 化学电离（化学电离（Chemical ionization Chemical ionization CICI ）第8页，共30页，编辑于2022年，星期一通常形成一系列准分子离子峰通常形成一系列准分子离子峰优点：优点：QM+稳定、寿命长，所得质谱离子峰强度很稳定、寿命长，所得质谱离子峰强度很 大大（是是EIEI中中M+的的100100倍）；灵敏度高倍）；灵敏度高缺点：缺点：谱简单，碎片峰少谱简单，碎片峰少QM+:M+1,M-1,M+17,M+29 等等第9页，共30页，编辑于2022年，星期一 3 场解吸（场解吸（Field desorption FD）机理：把少量的试样溶液置于金属丝上，对其进行加热，机理：把少量的试样溶液置于金属丝上，对其进行加热，其尖端的场强可高达其尖端的场强可高达108Vcm-1，可使样品中的一个，可使样品中的一个 电子电子 进入金属丝原子的空轨道，并在金属丝上形成进入金属丝原子的空轨道，并在金属丝上形成 正离子正离子()，在库仑斥力下被解吸，抛入气相在库仑斥力下被解吸，抛入气相 中而不发生分解中而不发生分解 优点：优点：解析温度低，适用于受热分解或难以气化的样品解析温度低，适用于受热分解或难以气化的样品第10页，共30页，编辑于2022年，星期一4 快原子轰击（快原子轰击（Fast atom bombardment FAB）三、质量分析器三、质量分析器第11页，共30页，编辑于2022年，星期一 扇形磁场仪器扇形磁场仪器 (Magnetic-sector instruments(Magnetic-sector instruments 第12页，共30页，编辑于2022年，星期一四、质谱中术语及离子四、质谱中术语及离子1、质谱术语、质谱术语基峰基峰质荷比质荷比2、质谱中离子、质谱中离子分子离子分子离子碎片离子碎片离子准分子离子准分子离子第13页，共30页，编辑于2022年，星期一第14页，共30页，编辑于2022年，星期一第二节第二节 生物质谱法生物质谱法一一 概述概述基质辅助激光解吸离子化质谱法基质辅助激光解吸离子化质谱法(matrix-assisted laser desorption ionizationmass spectrometry,MALDI/MS)电喷雾离子化质谱法电喷雾离子化质谱法(electrospray ionization mass spectrometryESI/MS)第15页，共30页，编辑于2022年，星期一二二 激光解吸离子化质谱法激光解吸离子化质谱法(LDI)1 离子化的方法离子化的方法经典方法经典方法 电子轰击电子轰击(EI)化学电离化学电离(CI)第16页，共30页，编辑于2022年，星期一粒子诱导离子化粒子诱导离子化快原子轰击快原子轰击 FABMS液体二次离子质谱法液体二次离子质谱法 LSIMS等离子解吸质谱法等离子解吸质谱法 PD用高能中性粒子或离子轰击样品用高能中性粒子或离子轰击样品激光解吸离子化质谱法激光解吸离子化质谱法(LDI)用光子轰击样品用光子轰击样品第17页，共30页，编辑于2022年，星期一2 MALDI原理原理供试品是供试品是小的小的,不吸收入射光，但是可以与其他能吸收入不吸收入射光，但是可以与其他能吸收入射光的分子共存。这样的分子可完整地被解吸成离子化，射光的分子共存。这样的分子可完整地被解吸成离子化，这种与供试品共存这种与供试品共存,能吸收入射激光。防止激光直接照射供试能吸收入射激光。防止激光直接照射供试品使之破坏的物质品使之破坏的物质,称为基质称为基质.在所采用的激光波长下在所采用的激光波长下,基质对激光有较强的吸收基质对激光有较强的吸收,而待测物对激光只有弱的吸收而待测物对激光只有弱的吸收.当激光打在基质晶当激光打在基质晶体时体时,聚集的能量加热晶体聚集的能量加热晶体,快速加热导致基质晶体快速加热导致基质晶体升华而将非挥发性的待测物释放到气相中升华而将非挥发性的待测物释放到气相中.第18页，共30页，编辑于2022年，星期一成为一个好的基质化合物应具备下述条件成为一个好的基质化合物应具备下述条件强烈吸收入射的激光波长强烈吸收入射的激光波长较低的气化温度较低的气化温度(气化最好是以升华的形式气化最好是以升华的形式)与供试物有共同的溶剂与供试物有共同的溶剂在固相溶液体系中能分离和包围被分析的在固相溶液体系中能分离和包围被分析的大分子而不形成共价键大分子而不形成共价键.第19页，共30页，编辑于2022年，星期一在在MALDI中基质的作用中基质的作用从激光束中吸收激光能量并转变为凝聚相的从激光束中吸收激光能量并转变为凝聚相的激发能激发能,导致相崩溃导致相崩溃(至少是样品表面分子层至少是样品表面分子层)基质对于供试品是大大过量的基质对于供试品是大大过量的,因此基质包围因此基质包围供试品分子供试品分子,使之相互隔离使之相互隔离,限制聚集体的形成限制聚集体的形成.供试品如聚集成很大的分子将不能解吸和分析供试品如聚集成很大的分子将不能解吸和分析.帮助供试品的离子化帮助供试品的离子化第20页，共30页，编辑于2022年，星期一第21页，共30页，编辑于2022年，星期一三三 实验技术实验技术1 小分子化合物的样品制备及基质选择小分子化合物的样品制备及基质选择2 生物聚合物样品制备及基质的选择生物聚合物样品制备及基质的选择第22页，共30页，编辑于2022年，星期一第23页，共30页，编辑于2022年，星期一结晶的方法结晶的方法一般是将样品一般是将样品-基质溶液加在样品靶上基质溶液加在样品靶上.室温室温下静置自然干燥下静置自然干燥,以长成的结晶以长成的结晶.这样长成的晶这样长成的晶往往存在往往存在热点热点“,在此处测定的灵敏度在此处测定的灵敏度,分辨率分辨率,准确度较高准确度较高.快速结晶法快速结晶法:既借助于热气流或真空使溶剂迅既借助于热气流或真空使溶剂迅速挥发速挥发,以长成细结晶以长成细结晶,这样靶面比较均匀这样靶面比较均匀,各部位各部位产生信号的差异较小产生信号的差异较小.两步制备法两步制备法第24页，共30页，编辑于2022年，星期一四 激光解吸离子化质谱的特征激光解吸离子化质谱的特征第三节第三节 电喷雾离子化质谱法电喷雾离子化质谱法一一 ESI ESI原理原理1 静电喷雾静电喷雾2 去溶剂化和离子蒸发去溶剂化和离子蒸发第25页，共30页，编辑于2022年，星期一二二 影响影响ESIESI的因素的因素1 1 样品的样品的PKaPKa和溶液的和溶液的PHPH值值第26页，共30页，编辑于2022年，星期一2 溶剂的性质溶剂的性质3 去溶剂时干燥气体的温度与流速去溶剂时干燥气体的温度与流速三三 生物分子的生物分子的ESIMSESIMS1 1 正离子质谱正离子质谱第27页，共30页，编辑于2022年，星期一2 蛋白质分子量的测定蛋白质分子量的测定系列中相邻峰值相差系列中相邻峰值相差1个电荷个电荷电荷是由于阳离子的加成电荷是由于阳离子的加成(通常为质子所致通常为质子所致,因而因而,每一个峰代表蛋白质分子加上一定数目每一个峰代表蛋白质分子加上一定数目的质子所形成的离子的质子所形成的离子,即即Mr+nHn+第28页，共30页，编辑于2022年，星期一第29页，共30页，编辑于2022年，星期一3 负离子质谱负离子质谱第30页，共30页，编辑于2022年，星期一