荧光定量分析方法.ppt

荧光分析法第二讲（荧光分析法第二讲（荧光分析法第二讲（荧光分析法第二讲（1 1 1 1学时）学时）学时）学时）要求：要求：要求：要求：1.1.掌握荧光强度与物质浓度的关系，定量分析方法；掌握荧光强度与物质浓度的关系，定量分析方法；掌握荧光强度与物质浓度的关系，定量分析方法；掌握荧光强度与物质浓度的关系，定量分析方法；2.2.了解荧光分光光度计与荧光分析技术新技术。了解荧光分光光度计与荧光分析技术新技术。了解荧光分光光度计与荧光分析技术新技术。了解荧光分光光度计与荧光分析技术新技术。第二节第二节第二节第二节 荧光定量分析方法荧光定量分析方法荧光定量分析方法荧光定量分析方法一一一一 荧光强度与物质浓度的关系：荧光强度与物质浓度的关系：荧光强度与物质浓度的关系：荧光强度与物质浓度的关系：由于荧光物质是在吸收光能而被激发之后才发射荧光由于荧光物质是在吸收光能而被激发之后才发射荧光由于荧光物质是在吸收光能而被激发之后才发射荧光由于荧光物质是在吸收光能而被激发之后才发射荧光的，因此溶液的荧光强度与该溶液中荧光物质吸收光能的的，因此溶液的荧光强度与该溶液中荧光物质吸收光能的的，因此溶液的荧光强度与该溶液中荧光物质吸收光能的的，因此溶液的荧光强度与该溶液中荧光物质吸收光能的程度以及荧光效率有关。程度以及荧光效率有关。程度以及荧光效率有关。程度以及荧光效率有关。溶液中荧光物质被入射光溶液中荧光物质被入射光溶液中荧光物质被入射光溶液中荧光物质被入射光(I(I0 0)激发后，可以在溶液的各激发后，可以在溶液的各激发后，可以在溶液的各激发后，可以在溶液的各个方向观察荧光强度个方向观察荧光强度个方向观察荧光强度个方向观察荧光强度(F)(F)。但由于激发光的一部分被透过，。但由于激发光的一部分被透过，。但由于激发光的一部分被透过，。但由于激发光的一部分被透过，因此，在因此，在因此，在因此，在激发光的方向观察荧光是不适宜的。一般是在与激发光的方向观察荧光是不适宜的。一般是在与激发光的方向观察荧光是不适宜的。一般是在与激发光的方向观察荧光是不适宜的。一般是在与激发光源垂直的方向观测。激发光源垂直的方向观测。激发光源垂直的方向观测。激发光源垂直的方向观测。设溶液中荧光物质浓度为设溶液中荧光物质浓度为设溶液中荧光物质浓度为设溶液中荧光物质浓度为C C C C，液层厚度为，液层厚度为，液层厚度为，液层厚度为L L L L。荧光强荧光强荧光强荧光强度正比于被荧光物质吸收的光强度，即：度正比于被荧光物质吸收的光强度，即：度正比于被荧光物质吸收的光强度，即：度正比于被荧光物质吸收的光强度，即：F F(I(I0 0-I)-I)为常数，其值取决于荧光效率为常数，其值取决于荧光效率为常数，其值取决于荧光效率为常数，其值取决于荧光效率根据根据根据根据BeerBeer定律定律定律定律（2 2）将将将将(2)(2)待人待人待人待人(1)(1)，得得得得即即即即（3 3）（1 1）根据根据根据根据 ，在低浓度时，溶液的荧，在低浓度时，溶液的荧，在低浓度时，溶液的荧，在低浓度时，溶液的荧光强度与溶液中荧光物质的浓度呈线性关系；但当光强度与溶液中荧光物质的浓度呈线性关系；但当光强度与溶液中荧光物质的浓度呈线性关系；但当光强度与溶液中荧光物质的浓度呈线性关系；但当EClECl0.050.05时时，(3)(3)式括号中第二式括号中第二式括号中第二式括号中第二项项以后的数以后的数以后的数以后的数值值就不能忽略，就不能忽略，就不能忽略，就不能忽略，此此此此时荧时荧光光光光强强度与溶液度与溶液度与溶液度与溶液浓浓度之度之度之度之间间不呈不呈不呈不呈线线性关系。性关系。性关系。性关系。为荧光定量分析法的依据。为荧光定量分析法的依据。为荧光定量分析法的依据。为荧光定量分析法的依据。若浓度若浓度若浓度若浓度C C很小，很小，很小，很小，EClECl之值也很小，当之值也很小，当之值也很小，当之值也很小，当EClECl0.050.05时时，上，上，上，上式第二式第二式第二式第二项项以后的各以后的各以后的各以后的各项项可以忽略。所以可以忽略。所以可以忽略。所以可以忽略。所以（4 4）荧光分析法的灵敏度比紫外分光光度法高，是因为：荧光分析法的灵敏度比紫外分光光度法高，是因为：荧光分析法的灵敏度比紫外分光光度法高，是因为：荧光分析法的灵敏度比紫外分光光度法高，是因为：荧光分析法中与浓度相关的参数是荧光物质发射的荧光强度，荧光分析法中与浓度相关的参数是荧光物质发射的荧光强度，荧光分析法中与浓度相关的参数是荧光物质发射的荧光强度，荧光分析法中与浓度相关的参数是荧光物质发射的荧光强度，测量的方式是在入射光的直角方向，在黑暗或很弱背景上检测测量的方式是在入射光的直角方向，在黑暗或很弱背景上检测测量的方式是在入射光的直角方向，在黑暗或很弱背景上检测测量的方式是在入射光的直角方向，在黑暗或很弱背景上检测所发射光所发射光所发射光所发射光(荧光荧光荧光荧光)的强度信号，测定的灵敏度取决于检测器的灵的强度信号，测定的灵敏度取决于检测器的灵的强度信号，测定的灵敏度取决于检测器的灵的强度信号，测定的灵敏度取决于检测器的灵敏度，可以通过增大检测信号的放大倍数来提高灵敏度，使极敏度，可以通过增大检测信号的放大倍数来提高灵敏度，使极敏度，可以通过增大检测信号的放大倍数来提高灵敏度，使极敏度，可以通过增大检测信号的放大倍数来提高灵敏度，使极微弱的荧光也能被检测到，可以测定很稀的溶液；而在分光光微弱的荧光也能被检测到，可以测定很稀的溶液；而在分光光微弱的荧光也能被检测到，可以测定很稀的溶液；而在分光光微弱的荧光也能被检测到，可以测定很稀的溶液；而在分光光度法中与浓度相关的参数是吸光度度法中与浓度相关的参数是吸光度度法中与浓度相关的参数是吸光度度法中与浓度相关的参数是吸光度(A=lgI(A=lgI0 0/I)/I)，是一个比值，是一个比值，是一个比值，是一个比值，如果增大检测器的放大倍数，检测到的入射光强度和透射光强如果增大检测器的放大倍数，检测到的入射光强度和透射光强如果增大检测器的放大倍数，检测到的入射光强度和透射光强如果增大检测器的放大倍数，检测到的入射光强度和透射光强度同时增大，比值仍然不变，对提高检测灵敏度不起作用，所度同时增大，比值仍然不变，对提高检测灵敏度不起作用，所度同时增大，比值仍然不变，对提高检测灵敏度不起作用，所度同时增大，比值仍然不变，对提高检测灵敏度不起作用，所以，荧光分析法的灵敏度比紫外分光光度法高，一般要高以，荧光分析法的灵敏度比紫外分光光度法高，一般要高以，荧光分析法的灵敏度比紫外分光光度法高，一般要高以，荧光分析法的灵敏度比紫外分光光度法高，一般要高2 233数量数量数量数量级级。二、定量分析方法二、定量分析方法二、定量分析方法二、定量分析方法1 1 依据：依据：依据：依据：荧光强度与荧光物质浓度的关系，在低浓度时二者成荧光强度与荧光物质浓度的关系，在低浓度时二者成荧光强度与荧光物质浓度的关系，在低浓度时二者成荧光强度与荧光物质浓度的关系，在低浓度时二者成线性关系：线性关系：线性关系：线性关系：F=KCF=KC2 2 荧光定量分析方法：荧光定量分析方法：荧光定量分析方法：荧光定量分析方法：(1)(1)校正曲线法：校正曲线法：校正曲线法：校正曲线法：配制配制配制配制空白溶液以及空白溶液以及空白溶液以及空白溶液以及一系列浓度梯度的待测物的一系列浓度梯度的待测物的一系列浓度梯度的待测物的一系列浓度梯度的待测物的标准溶液，试样经过相同的处理之后分别测定荧光强度：标准溶液，试样经过相同的处理之后分别测定荧光强度：标准溶液，试样经过相同的处理之后分别测定荧光强度：标准溶液，试样经过相同的处理之后分别测定荧光强度：F F0 0、F Fs s、F Fx x，然后作（，然后作（，然后作（，然后作（F Fs s-F F0 0）C C 曲线，根据（曲线，根据（曲线，根据（曲线，根据（F Fx x F F0 0)，从，从，从，从工作曲线上求得待测物的浓度（或含量）。工作曲线上求得待测物的浓度（或含量）。工作曲线上求得待测物的浓度（或含量）。工作曲线上求得待测物的浓度（或含量）。(2)(2)比例法：比例法：比例法：比例法：如果荧光物质溶液的工作曲线通过原点，就可如果荧光物质溶液的工作曲线通过原点，就可如果荧光物质溶液的工作曲线通过原点，就可如果荧光物质溶液的工作曲线通过原点，就可选择其线性范围，用直接比较法进行测定：选择其线性范围，用直接比较法进行测定：选择其线性范围，用直接比较法进行测定：选择其线性范围，用直接比较法进行测定：F Fs s-F F0 0 =KCKCs s ，F Fx x-F F0 0=KCKCx x 例题：例题：例题：例题：1g1g谷物的制品试样，用酸处理，分离出核黄素谷物的制品试样，用酸处理，分离出核黄素谷物的制品试样，用酸处理，分离出核黄素谷物的制品试样，用酸处理，分离出核黄素(V(VB2B2)及少量无关杂质，加入少量及少量无关杂质，加入少量及少量无关杂质，加入少量及少量无关杂质，加入少量KMnOKMnO4 4，将核黄素氧化，过量，将核黄素氧化，过量，将核黄素氧化，过量，将核黄素氧化，过量的的的的KMnOKMnO4 4用用用用HH2 2OO2 2除去。将此溶液移入除去。将此溶液移入除去。将此溶液移入除去。将此溶液移入50ml50ml容量瓶中，稀释容量瓶中，稀释容量瓶中，稀释容量瓶中，稀释至刻度。吸取至刻度。吸取至刻度。吸取至刻度。吸取25ml25ml放入样品池中以测量荧光强度（核黄素中放入样品池中以测量荧光强度（核黄素中放入样品池中以测量荧光强度（核黄素中放入样品池中以测量荧光强度（核黄素中常含有荧光的杂质叫光化黄）。事先将荧光计用硫酸奎宁调常含有荧光的杂质叫光化黄）。事先将荧光计用硫酸奎宁调常含有荧光的杂质叫光化黄）。事先将荧光计用硫酸奎宁调常含有荧光的杂质叫光化黄）。事先将荧光计用硫酸奎宁调整至刻度整至刻度整至刻度整至刻度100100处。测定得到氧化液的读数为处。测定得到氧化液的读数为处。测定得到氧化液的读数为处。测定得到氧化液的读数为6.06.0格。加入少量格。加入少量格。加入少量格。加入少量的连二亚硫酸钠的连二亚硫酸钠的连二亚硫酸钠的连二亚硫酸钠(Na(Na2 2S S2 2OO4 4)，使氧化态核黄素（无荧光）重，使氧化态核黄素（无荧光）重，使氧化态核黄素（无荧光）重，使氧化态核黄素（无荧光）重新转化为核黄素，这时荧光计读数为新转化为核黄素，这时荧光计读数为新转化为核黄素，这时荧光计读数为新转化为核黄素，这时荧光计读数为5555格。在另一样品池中格。在另一样品池中格。在另一样品池中格。在另一样品池中重新加入重新加入重新加入重新加入24ml24ml被氧化的核黄素溶液，以及被氧化的核黄素溶液，以及被氧化的核黄素溶液，以及被氧化的核黄素溶液，以及1ml1ml核黄素标准溶核黄素标准溶核黄素标准溶核黄素标准溶液液液液0.50.5g/mlg/ml，这这一溶液的一溶液的一溶液的一溶液的读读数数数数为为9292格，格，格，格，计计算每克算每克算每克算每克样样品中含核品中含核品中含核品中含核黄素的黄素的黄素的黄素的gg数？数？数？数？(课本课本课本课本P P2302307 7题题题题)解：解：解：解：25ml25ml氧化液：荧光读数氧化液：荧光读数氧化液：荧光读数氧化液：荧光读数6.06.0格，相当于空白背景；格，相当于空白背景；格，相当于空白背景；格，相当于空白背景；25ml 25ml测定液：荧光读数测定液：荧光读数测定液：荧光读数测定液：荧光读数5555格，实际核黄素的荧光读数为格，实际核黄素的荧光读数为格，实际核黄素的荧光读数为格，实际核黄素的荧光读数为55-6.0=4955-6.0=49格；格；格；格；24ml 24ml氧化液氧化液氧化液氧化液+1ml+1ml标准核黄素：荧光读数标准核黄素：荧光读数标准核黄素：荧光读数标准核黄素：荧光读数9292格；格；格；格；标准核黄素标准核黄素标准核黄素标准核黄素0.5g/ml0.5g/ml：荧光读数：荧光读数：荧光读数：荧光读数92-6=8692-6=86格；格；格；格；样品溶液的浓度为：样品溶液的浓度为：样品溶液的浓度为：样品溶液的浓度为：1g1g谷物配成谷物配成谷物配成谷物配成50ml50ml溶液，取溶液，取溶液，取溶液，取25ml25ml测定，故谷物中核黄素为：测定，故谷物中核黄素为：测定，故谷物中核黄素为：测定，故谷物中核黄素为：第三节第三节第三节第三节 荧光分光光度计和荧光分析新技术荧光分光光度计和荧光分析新技术荧光分光光度计和荧光分析新技术荧光分光光度计和荧光分析新技术一一一一 荧光分光光度计荧光分光光度计荧光分光光度计荧光分光光度计(fluorospectrophotometer):(fluorospectrophotometer):1 1 主要部件：主要部件：主要部件：主要部件：主要由四个部分组成即激发光源、样品池、主要由四个部分组成即激发光源、样品池、主要由四个部分组成即激发光源、样品池、主要由四个部分组成即激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。双单色器系统、检测器。双单色器系统、检测器。双单色器系统、检测器。特点：特点：特点：特点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角有两个单色器，光源与检测器通常成直角有两个单色器，光源与检测器通常成直角有两个单色器，光源与检测器通常成直角2 2 仪器的校正：仪器的校正：仪器的校正：仪器的校正：(1)(1)灵敏度的校正：灵敏度的校正：灵敏度的校正：灵敏度的校正：(2)(2)波长校正波长校正波长校正波长校正：(3)(3)激发光谱和荧光光谱的校激发光谱和荧光光谱的校激发光谱和荧光光谱的校激发光谱和荧光光谱的校正：正：正：正：二二二二 荧光分析新技术简介荧光分析新技术简介荧光分析新技术简介荧光分析新技术简介1 1 激光荧光分析法激光荧光分析法激光荧光分析法激光荧光分析法2 2 时间分辨荧光分析时间分辨荧光分析时间分辨荧光分析时间分辨荧光分析3 3 同步荧光分析同步荧光分析同步荧光分析同步荧光分析4 4 胶束增敏荧光分析胶束增敏荧光分析胶束增敏荧光分析胶束增敏荧光分析小结小结小结小结1.1.荧光荧光荧光荧光(fluorescence)(fluorescence)：物质分子接受光子能量被激发后，物质分子接受光子能量被激发后，物质分子接受光子能量被激发后，物质分子接受光子能量被激发后，从激发态的最低振动能级返回基态时发射出的光。从激发态的最低振动能级返回基态时发射出的光。从激发态的最低振动能级返回基态时发射出的光。从激发态的最低振动能级返回基态时发射出的光。2.2.磷光磷光磷光磷光(phosphorescence)phosphorescence)：物质分子接受光子能量被激发后，物质分子接受光子能量被激发后，物质分子接受光子能量被激发后，物质分子接受光子能量被激发后，经过体系间跨越再通过振动弛豫降至激发三重态的最低振动经过体系间跨越再通过振动弛豫降至激发三重态的最低振动经过体系间跨越再通过振动弛豫降至激发三重态的最低振动经过体系间跨越再通过振动弛豫降至激发三重态的最低振动能级后再能级后再能级后再能级后再返回基态时发射出的光。返回基态时发射出的光。返回基态时发射出的光。返回基态时发射出的光。3.3.分子荧光的产生：分子荧光的产生：分子荧光的产生：分子荧光的产生：处于基态的分子，吸收紫外处于基态的分子，吸收紫外处于基态的分子，吸收紫外处于基态的分子，吸收紫外-可见光后，可见光后，可见光后，可见光后，电子由基态电子由基态电子由基态电子由基态激发单重态，激发态的分子不稳定，它通过辐激发单重态，激发态的分子不稳定，它通过辐激发单重态，激发态的分子不稳定，它通过辐激发单重态，激发态的分子不稳定，它通过辐射跃迁和无辐射跃迁等去活化过程释放能量而迅速返回至基射跃迁和无辐射跃迁等去活化过程释放能量而迅速返回至基射跃迁和无辐射跃迁等去活化过程释放能量而迅速返回至基射跃迁和无辐射跃迁等去活化过程释放能量而迅速返回至基态。无论处于哪一个激发单重态，通过内转换和振动弛豫均态。无论处于哪一个激发单重态，通过内转换和振动弛豫均态。无论处于哪一个激发单重态，通过内转换和振动弛豫均态。无论处于哪一个激发单重态，通过内转换和振动弛豫均可返回至第一激发单重态的最低振动能级，然后再以辐射形可返回至第一激发单重态的最低振动能级，然后再以辐射形可返回至第一激发单重态的最低振动能级，然后再以辐射形可返回至第一激发单重态的最低振动能级，然后再以辐射形式发射光量子而返回至基态，所发射的光称为荧光。式发射光量子而返回至基态，所发射的光称为荧光。式发射光量子而返回至基态，所发射的光称为荧光。式发射光量子而返回至基态，所发射的光称为荧光。4.4.分子处于激发态后，去活化过程主要有以下六种方式：分子处于激发态后，去活化过程主要有以下六种方式：分子处于激发态后，去活化过程主要有以下六种方式：分子处于激发态后，去活化过程主要有以下六种方式：(1)(1)振动弛豫振动弛豫振动弛豫振动弛豫(vibrationalvibrational relexationrelexation)：(2)(2)内部能量转换内部能量转换内部能量转换内部能量转换(internal conversion)(internal conversion)：(3)(3)荧光发射：荧光发射：荧光发射：荧光发射：(4)(4)外部能量转换外部能量转换外部能量转换外部能量转换(external conversion)(external conversion)：(5)(5)体系间跨越体系间跨越体系间跨越体系间跨越(intersystem conversion)(intersystem conversion)：(6)(6)磷光发射：磷光发射：磷光发射：磷光发射：S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越内转换振动弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外转换l l 2T2内转换振动弛豫荧光和磷光产生示意图荧光和磷光产生示意图5.5.荧光的激发光谱和发射光谱：荧光的激发光谱和发射光谱：荧光的激发光谱和发射光谱：荧光的激发光谱和发射光谱：可用来鉴别荧光物质，并可用来鉴别荧光物质，并可用来鉴别荧光物质，并可用来鉴别荧光物质，并作为选择适当测定波长的依据。作为选择适当测定波长的依据。作为选择适当测定波长的依据。作为选择适当测定波长的依据。6.6.溶液荧光光谱的特征：溶液荧光光谱的特征：溶液荧光光谱的特征：溶液荧光光谱的特征：（1 1）斯托克斯位移：荧光波长总是大于激发光波长；）斯托克斯位移：荧光波长总是大于激发光波长；）斯托克斯位移：荧光波长总是大于激发光波长；）斯托克斯位移：荧光波长总是大于激发光波长；（2 2）荧光光谱的形状与激发光波长无关；）荧光光谱的形状与激发光波长无关；）荧光光谱的形状与激发光波长无关；）荧光光谱的形状与激发光波长无关；（3 3）荧光光谱与激发光谱的镜像关系。）荧光光谱与激发光谱的镜像关系。）荧光光谱与激发光谱的镜像关系。）荧光光谱与激发光谱的镜像关系。7.7.荧光寿命和荧光效率：荧光寿命和荧光效率：荧光寿命和荧光效率：荧光寿命和荧光效率：是描述荧光物质的重要发光参数。是描述荧光物质的重要发光参数。是描述荧光物质的重要发光参数。是描述荧光物质的重要发光参数。8.8.发射荧光的物质应具备的条件：发射荧光的物质应具备的条件：发射荧光的物质应具备的条件：发射荧光的物质应具备的条件：（1 1）物质必须有强的紫外）物质必须有强的紫外）物质必须有强的紫外）物质必须有强的紫外-可见吸收；可见吸收；可见吸收；可见吸收；（2 2）物质必须具有一定的荧光效率。）物质必须具有一定的荧光效率。）物质必须具有一定的荧光效率。）物质必须具有一定的荧光效率。9.9.分子结构与荧光的关系：分子结构与荧光的关系：分子结构与荧光的关系：分子结构与荧光的关系：（1 1）长共轭分子具有）长共轭分子具有）长共轭分子具有）长共轭分子具有*跃迁的具有较强的荧光强度；跃迁的具有较强的荧光强度；跃迁的具有较强的荧光强度；跃迁的具有较强的荧光强度；（2 2）刚性平面结构分子具有较强的荧光效率；）刚性平面结构分子具有较强的荧光效率；）刚性平面结构分子具有较强的荧光效率；）刚性平面结构分子具有较强的荧光效率；（3 3）共轭体系上的取代基对荧光光谱和荧光强度有很大影响。）共轭体系上的取代基对荧光光谱和荧光强度有很大影响。）共轭体系上的取代基对荧光光谱和荧光强度有很大影响。）共轭体系上的取代基对荧光光谱和荧光强度有很大影响。10.10.影响荧光强度的外部因素：影响荧光强度的外部因素：影响荧光强度的外部因素：影响荧光强度的外部因素：（1 1）温度；）温度；）温度；）温度；（2 2）溶剂；）溶剂；）溶剂；）溶剂；（3 3）pHpH；（4 4）荧光熄灭剂；）荧光熄灭剂；）荧光熄灭剂；）荧光熄灭剂；（5 5）散射光：尤其是拉曼光）散射光：尤其是拉曼光）散射光：尤其是拉曼光）散射光：尤其是拉曼光11.11.荧光的定量分析方法：荧光的定量分析方法：荧光的定量分析方法：荧光的定量分析方法：当当当当ECl0.05ECl0.05时时时时12.12.比例定量法：比例定量法：比例定量法：比例定量法：或或或或注意：注意：注意：注意：1.1.荧光物质的最大激发波长和最大荧光波长是鉴定物质的荧光物质的最大激发波长和最大荧光波长是鉴定物质的荧光物质的最大激发波长和最大荧光波长是鉴定物质的荧光物质的最大激发波长和最大荧光波长是鉴定物质的依据，也是定量测定时最灵敏的条件；依据，也是定量测定时最灵敏的条件；依据，也是定量测定时最灵敏的条件；依据，也是定量测定时最灵敏的条件；2.2.当荧光物质的激发光谱有两个峰时，不管用哪一个峰的当荧光物质的激发光谱有两个峰时，不管用哪一个峰的当荧光物质的激发光谱有两个峰时，不管用哪一个峰的当荧光物质的激发光谱有两个峰时，不管用哪一个峰的波长作为激发光，荧光光谱只出现一个峰。这是因为无论波长作为激发光，荧光光谱只出现一个峰。这是因为无论波长作为激发光，荧光光谱只出现一个峰。这是因为无论波长作为激发光，荧光光谱只出现一个峰。这是因为无论分子激发到分子激发到分子激发到分子激发到 ，荧光的发生总是从，荧光的发生总是从，荧光的发生总是从，荧光的发生总是从 的最低振的最低振的最低振的最低振动能级开始的。动能级开始的。动能级开始的。动能级开始的。作业：作业：作业：作业：1.1.课本课本课本课本P P2292294 4、5 5、6 6；2.2.学习指导相应习题。学习指导相应习题。学习指导相应习题。学习指导相应习题。