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细细胞融合概述胞融合概述1.细细胞融合（胞融合（cell fusion)，又称体细胞杂交（somatic hybridiazation），是指两个或更多个相同或不同细胞通过膜 融合形成单个细胞的过程。一、一、细细胞融合的定胞融合的定义义2.uMuller于1838年观察到脊椎动的肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞。uVirchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。uLuginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在。uLange于1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。uCienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在无脊椎动中发现了细胞合并现象。u1958年日本学者冈田（Okada）发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。u1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。u1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。u20世纪80年代出现了电融合技术。二、二、细细胞融合研究胞融合研究进进展展3.生物种生物种生物种生物种类类类类细细细细胞来源胞来源胞来源胞来源成功年代成功年代成功年代成功年代烟草两个种烟草两个种间间苷苷蓝蓝青菜青菜大豆大豆马马唐草唐草矮矮牵牵牛牛龙龙面花面花大麦大麦花生花生大麦大麦大豆大豆小麦小麦矮矮牵牵牛牛油菜油菜大豆大豆玉米玉米大豆大豆大豆大豆野豌豆野豌豆大麦大麦蚕豆蚕豆大豆大豆草香木犀草香木犀酵母菌酵母菌鸡鸡大豆大豆烟草烟草大豆大豆秋水仙秋水仙人人胡胡萝萝卜卜番茄番茄马铃马铃薯薯人人小鼠小鼠叶叶叶叶叶叶根根愈愈伤组织伤组织叶叶叶叶花瓣花瓣种子种子种子种子叶叶悬悬浮浮细细胞胞叶叶花瓣花瓣叶叶悬悬浮浮细细胞胞叶叶悬悬浮浮细细胞胞悬悬浮浮细细胞胞悬悬浮浮细细胞胞叶叶根根悬悬浮浮细细胞胞叶叶原生原生质质体体血血红细红细胞胞悬悬浮浮细细胞胞叶叶悬悬浮浮细细胞胞叶叶腹水癌腹水癌细细胞胞原生原生质质体体叶叶根尖根尖纤维纤维肉瘤肉瘤细细胞胞畸胎瘤畸胎瘤细细胞胞197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972几种几种细细胞融合成功的例子胞融合成功的例子4.植物融合植物融合细细胞成胞成长长状状态对态对比比,右瓶右瓶为为地面融合的地面融合的细细胞，左瓶中胞，左瓶中为为太空微重力太空微重力环环境下融合的境下融合的细细胞胞 5.动物细胞融合实验使用的小白鼠 6.三、三、动动植物植物细细胞的融合胞的融合过过程程植物植物细细胞融合胞融合过过程程人造小鼠培育人造小鼠培育过过程示意程示意图图7.四、四、细细胞融合的意胞融合的意义义u理理论论上上说说任何任何细细胞，都有可能通胞，都有可能通过过体体细细胞胞杂杂交而成交而成为为新的生物新的生物资资源。源。这这 对对于种于种质资质资源的开源的开发发和利用具有深和利用具有深远远的意的意义义。u融合融合过过程程不存在有性不存在有性杂杂交交过过程中的种性隔离机制的限制程中的种性隔离机制的限制，为远缘为远缘物种物种间间 的的遗传遗传物物质质交交换换提供了有效途径。提供了有效途径。u体体细细胞胞杂杂交交产产生的生的杂杂种种细细胞含有来自双胞含有来自双亲亲的核外的核外遗传遗传系系统统，在，在杂杂种的分种的分 裂和增殖裂和增殖过过程中双程中双亲亲的叶的叶绿绿体、体、线线粒体粒体DNA亦可亦可发发生重生重组组，从而，从而产产生新生新 的核外的核外遗传遗传系系统统。u淋巴淋巴细细胞胞杂杂交瘤和交瘤和单单克隆抗体的制克隆抗体的制备备。8.细细胞融合的基本原理胞融合的基本原理9.显显微微镜镜下下细细胞融合胞融合过过程程10.融合融合过过程中两个程中两个细细胞膜从彼此接触到破裂形成胞膜从彼此接触到破裂形成细细胞胞桥桥的的变变化化过过程程图图解解11.用用灭灭活的病毒活的病毒诱导诱导的的动动物物细细胞融合胞融合过过程示意程示意图图 12.细细胞融合的常用方法胞融合的常用方法13.一、仙台病毒法一、仙台病毒法仙台病毒仙台病毒诱导细诱导细胞融合胞融合经经四个四个阶阶段：段：两种细胞在一起培养，加入病毒，在4条件下病毒附着在细胞 膜上。并使两细胞相互凝聚；在37中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破环，此时需 要Ca2+和Mg2+，最适PH为8.0一8.2；细胞膜连接部穿通，周边连接部修复，此时需Ca2+和ATP；融合成巨大细胞，仍需ATP。14.病毒促使病毒促使细细胞融合的主要步胞融合的主要步骤骤如下：如下：1.两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近；2.通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透；3.两个原生质体的细胞核互相融合，两个细胞融为一体；4.进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂种细胞。15.用用灭灭活的病毒活的病毒诱导诱导的的动动物物细细胞融合胞融合过过程示意程示意图图 16.u 优点是易得，用法简单，融合效果稳定。u聚乙二醇(PEG)结构为：HOH2C（CH20CH2）nCH2OH，分子量大于200小于6000者均可用作细胞融合剂。uPEG浓度以W/W；如将10克PEG与10mlEagLe氏液混合（假定1ml培养液为1g重)，即成50PEG溶液。uPEG经高压灭菌后，与温热的Engle氏液混合。u通常用分子量低于1000的PEG作融合剂最好，50PEG溶液能产生最多杂交细胞。uPEG溶液在pH6.0时细胞融合率最高。二、聚乙二醇（二、聚乙二醇（PEG）法）法17.聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）法）法细细胞融合胞融合过过程程18.PEG的作用机理的作用机理：Kao等等认为认为，由于，由于PEG分子分子具有具有轻轻微的微的负负极性，故可以与具有正极性基极性，故可以与具有正极性基团团的水、蛋白的水、蛋白质质和碳水化合物等形成和碳水化合物等形成H键键，从而，从而在在在在质质膜之膜之间间形成分子形成分子桥桥，其，其结结果是使果是使细细胞胞质质膜膜发发生粘生粘连进连进而促使而促使质质膜的融合；另外，膜的融合；另外，PEG能增加能增加类类脂膜的流脂膜的流动动性，也使性，也使细细胞的核、胞的核、细细胞胞器器发发生融合成生融合成为为可能。可能。PEG诱导诱导融合的特点融合的特点：其其优优点是融合成本低，勿需特殊点是融合成本低，勿需特殊设备设备；融合子；融合子产产生的异核率生的异核率较较高；融合高；融合过过程不受物种限程不受物种限制。其缺点是融合制。其缺点是融合过过程繁程繁琐琐，PEG可能可能对细对细胞有毒害。胞有毒害。19.聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）法）法细细胞融合步胞融合步骤骤（1）将两种不同亲本细胞各5l06混匀；（2）离心沉淀，吸去上清液；（3）加1ml 50PEG溶液，用吸管吹打，使之与细胞接触1分钟；（4）加9ml 培养液，离心沉淀，吸去上清液；（5）加5ml 培养液，分别接种5个直径60mm平皿，每个平皿加培养 液至 5ml，37的CO2培养箱中培养。（6）624小时后，换成选择培养液筛选杂交细胞。20.21.三、三、电电融合法融合法 电融合法是80年代出现的细胞融合技术，在直流电脉冲的诱导下，细胞膜表面的氧化还原电位发生改变，使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜，形成融合体。电电融合法的融合法的优优点：点：u融合率高、重复性强、对细胞伤害小；u装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察或录像观察融合过程；u免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强。22.电电融合的基本融合的基本过过程：程：细细胞膜的接触：胞膜的接触：当原生当原生质质体置于体置于电导电导率很低的溶液中率很低的溶液中时时，电场电场通通电电后，后，电电流即通流即通过过原生原生质质体而不是通体而不是通过过溶液，其溶液，其结结果是原生果是原生质质体在体在电场电场作用下极化而作用下极化而产产生偶极子，从而使原生生偶极子，从而使原生质质体体紧紧密接触排列成串；密接触排列成串；膜的膜的击击穿：穿：原生原生质质体成串排列后，立即体成串排列后，立即给给予高予高频频直流脉冲就可以直流脉冲就可以使原生使原生质质膜膜击击穿，从而穿，从而导导致两个致两个紧紧密接触的密接触的细细胞融合在一起。胞融合在一起。23.电电融合融合诱导诱导法原理示意法原理示意图图24.杂杂种种细细胞的胞的筛选筛选25.杂杂种种细细胞的胞的筛选筛选n原理：两种亲本细胞融合的混合物中可能有多种类型细胞，筛选的目的是获得优良的杂种细胞。n1）亲本 n2）同核体：同源原生质体的融合体n3）异核体：非同源的原生质体的融合体n4）多核体：含有双亲不同比例核物质的融合体n5）异胞质体：具有不同胞质来源的杂合细胞。n6）核质体：有细胞核而带有少量细胞质的亚原生质体26.u基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立的杂种筛选u基于营养缺陷型细胞所建立的杂种筛选u由温度敏感型细胞组成的杂种细胞的筛选u具有所需性状杂种细胞的筛选常用的常用的杂杂种种细细胞胞筛选筛选方法方法27.植物细胞筛选方式1）遗传互补筛选法：利用每一亲本贡献一个功能正常等位基因，纠正另一亲本的缺陷，令杂种细胞表现正常。n 如亲本1：叶绿体缺陷型 亲本2：光致死型 两亲本在光照下一种死亡，另一种呈白 色，融合细胞长成植株呈绿色，并能成长28.n2）抗性互补筛选法：利用亲本细胞原生质体对抗生素、除草剂及其它有毒物质抗性差异选择杂种细胞。n如：n亲本1：对放线菌素D抗性，但在MS培养基上不能超过50个世代n亲本2：对放线菌素D很敏感，但能在MS上生长n杂种细胞能在含有放线菌素的MS培养基上生长，而亲本和其它细胞死亡29.3）利用物理特性筛选法：根据亲本的原生质体大小、颜色、漂浮密度及电泳迁移率、形成的愈伤组织的差异筛选杂种细胞。亲本1：用异硫氰酸荧光素染色原生质体 亲本2：叶肉细胞原生质体 在荧光显微镜下，亲本1为红色，亲本2为绿色，杂种细胞可以区分30.n4）利用生长特性筛选法：利用原生质体对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞。n例如粉兰烟草与朗氏烟草细胞原生质体均需外源激素才能生长，但其融合细胞可以产生内源激素，在培养基上不需加激素。31.动物细胞的筛选方式：n1）利用抗药性筛选系统：利用生物细胞对药物敏感性差异筛选杂种细胞。n亲本A：对氨苄青霉素敏感，对卡娜霉素不敏感n亲本B：对卡娜霉素敏感，对氨苄青霉素不敏感n杂种细胞可以在含有两种抗生素的培养基上生长32.n2）营养互补筛选系统：细胞在缺乏一种或几种营养成分时，不能生长繁殖，即营养缺陷型细胞。利用两种亲本细胞营养互补作用原理可以筛选杂种细胞。n亲本A：色氨酸缺陷型n亲本B：苏氨酸缺陷型n杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上培养，而亲本细胞均会死亡。33.n3）温度敏感突变型杂种细胞的筛选：一般的培养细胞能在32度到40度的范围内生长，但温度敏感突变型的细胞能在高温或低温下生长。由此筛选杂种细胞。n亲本一：具有卡那霉素抗性但只能在37度左右生长。n亲本二：高温敏感突变型，但不能抗卡娜霉素。n杂种细胞能在高温和含卡娜霉素的培养基上生长。34.1杂杂种种细细胞的胞的遗传遗传特性和特性和应应用用2杂杂种种细细胞在胞在细细胞生物学研究胞生物学研究中的中的应应用用3杂杂种种细细胞在植物育种中的胞在植物育种中的应应用用35.1 1 杂杂种种细细胞在胞在细细胞生物学研究中的胞生物学研究中的应应用用n1 1）基因定位基因定位 不同种属的不同种属的细细胞融合胞融合时时，常会出，常会出现现一个一个亲亲本本细细胞的染色体被胞的染色体被优优先排除，而另一个先排除，而另一个亲亲本的染色本的染色体被体被选择选择性留下，即性留下，即染色体分离染色体分离的的现现象。由此，象。由此，可根据表型和与表型特征相可根据表型和与表型特征相对应对应的基因在特定的基因在特定染色体上。染色体上。例如例如 ：HGPRTHGPRT人人细细胞与胞与TKTK的小鼠的小鼠细细胞融合后，胞融合后，可用可用HATHAT培养基分离得到一种培养基分离得到一种仅仅含一条人含一条人E E组组染染色体的色体的杂杂种种细细胞，具有胞，具有TKTK活性，由此得到人的活性，由此得到人的TKTK基因是在基因是在E E组组染色体上的。染色体上的。36.n n2 2）体体细细胞胞杂杂种的致瘤性分析种的致瘤性分析 通通过过正常二倍体正常二倍体细细胞和致瘤性或病毒胞和致瘤性或病毒转转化化细细胞的融合来胞的融合来进进行致瘤性的行致瘤性的遗传遗传分析。分析。n n3 3）遗传遗传缺陷的基因互缺陷的基因互补补 基于基于杂杂种种细细胞的基因互胞的基因互补补作用，可分作用，可分为为基基因因间间和基因内的互和基因内的互补补作用，即作用，即杂杂种种细细胞可胞可以具有两种以具有两种亲亲本在本在遗传遗传上缺陷的基因表型。上缺陷的基因表型。通通过这过这种基因互种基因互补补，可以用正常基因来治，可以用正常基因来治疗疗由于基因突由于基因突变变或基因缺失的疾病。或基因缺失的疾病。37.n n4 4）分化功能表达分化功能表达调调控的研究控的研究n n通通过细过细胞融合可将不同分化状胞融合可将不同分化状态态或或组组织类织类型的型的细细胞构建成胞构建成为为能能够够存活的种存活的种内或种内或种间杂间杂种，同种，同时对杂时对杂种种细细胞内的胞内的基因基因组组和胞和胞质观质观察和分析，了解如何察和分析，了解如何通通过过相互作用而最相互作用而最终导终导致原先表达的致原先表达的分化性状熄分化性状熄灭灭或保留。或保留。38.2 2杂杂种种细细胞在植物胞在植物育种中的育种中的应应用用n n杂杂杂杂种种种种细细细细胞胞胞胞是一条是一条是一条是一条新的育种途新的育种途新的育种途新的育种途径径径径，可以，可以，可以，可以产产产产生新生新生新生新经济经济经济经济性状的性状的性状的性状的良种。良种。良种。良种。n n科学家已科学家已科学家已科学家已经经经经在禾本科、茄科、在禾本科、茄科、在禾本科、茄科、在禾本科、茄科、豆科、十字花科等植物中得豆科、十字花科等植物中得豆科、十字花科等植物中得豆科、十字花科等植物中得到了到了到了到了杂杂杂杂种再生植株。种再生植株。种再生植株。种再生植株。n n一些近一些近一些近一些近亲亲亲亲植物、有性不植物、有性不植物、有性不植物、有性不亲亲亲亲和和和和的的的的组组组组合，如合，如合，如合，如马铃马铃马铃马铃薯薯薯薯 番茄等都番茄等都番茄等都番茄等都得到了再生植株。得到了再生植株。得到了再生植株。得到了再生植株。n n目目目目标标标标：地上和地下部兼用种、：地上和地下部兼用种、：地上和地下部兼用种、：地上和地下部兼用种、固氮禾等固氮禾等固氮禾等固氮禾等具有两种不同具有两种不同具有两种不同具有两种不同优势优势优势优势性状的新品种性状的新品种性状的新品种性状的新品种。39.3、细细胞融合技胞融合技术术 在食品工在食品工业业中的中的应应用用n（1）酵母菌的育种）酵母菌的育种n（2）氨基酸生）氨基酸生产产菌的育种菌的育种n（3）酶酶制制剂剂生生产产菌株的育种菌株的育种40.思考：n1、植物杂种细胞筛选有哪些方法？n2、动物杂种细胞筛选有哪些方法？n3、促进细胞融合的方法有哪些，各自的优缺点及应用。41.细细胞胞杂杂交瘤技交瘤技术术 与与单单克隆抗体克隆抗体42.一、何一、何谓单谓单克隆抗体？克隆抗体？43.44.45.46.只只针对针对某一抗原决定簇的抗体分子称某一抗原决定簇的抗体分子称为为单单克隆抗体克隆抗体。47.单单克隆抗体技克隆抗体技术术的核心是用的核心是用骨髓瘤骨髓瘤细细胞胞(myeloma cell)与与经经特定抗源免疫刺激的特定抗源免疫刺激的B淋巴淋巴细细胞胞(antigen stimulated B lymphoblast)融合得到融合得到杂杂交瘤交瘤细细胞胞(hybridoma cell)，杂杂交瘤交瘤细细胞既能象骨髓瘤胞既能象骨髓瘤细细胞那胞那样样在体外无限增殖，又具有在体外无限增殖，又具有B淋巴淋巴细细胞胞产产生特异性抗体的能力。因此，生特异性抗体的能力。因此，单单克隆抗体技克隆抗体技术术又称又称为杂为杂交瘤技交瘤技术术(hybridoma technology）。）。48.Niels K.Jerne G.Kohler C.Milstein 49.二、二、杂杂交瘤技交瘤技术术的基本原理的基本原理50.三、三、杂杂交瘤交瘤细细胞的制胞的制备备（一）骨髓瘤（一）骨髓瘤细细胞胞选择选择及及选择选择性培养基性培养基骨髓瘤骨髓瘤细细胞本身不能分泌抗体胞本身不能分泌抗体选择选择次黄次黄嘌嘌呤呤鸟鸟嘌嘌呤呤转转磷酸核糖激磷酸核糖激酶酶缺陷型缺陷型（HGPRT-）胸腺胸腺嘧啶嘧啶核苷激核苷激酶酶缺陷型（缺陷型（TK-）51.HAT培养基培养基次黄嘌呤（hypoxanthine，H）氨基喋呤（aminopterin，A）胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidine，T）次黄次黄嘌嘌呤呤鸟鸟嘌嘌呤呤转转磷酸核糖激磷酸核糖激酶酶缺陷型（缺陷型（HGPRT-）胸腺胸腺嘧啶嘧啶核苷激核苷激酶酶缺陷型（缺陷型（TK-）52.（二）免疫小鼠（二）免疫小鼠 免疫程序是取68周龄BalbC雌鼠，基础免疫2周，静脉再加强免疫一次，35天后用于融合。免疫时是否采用佐剂和事先处理抗原，要依抗原性的强弱而定。一般来讲可溶性抗原用完全佐剂效果较好。抗原量同样与抗原强弱有关，以IgG为例，第一次为loog，第二次为50g，免疫途径第一次可经腹腔注射。对于细胞性抗原不用佐剂，每次腹腔注射1l06一1107。53.（三）脾（三）脾细细胞的制胞的制备备(1)(1)引引颈处颈处死小鼠，用酒精消毒体表；死小鼠，用酒精消毒体表；(2)(2)无菌条件下取出脾无菌条件下取出脾脏脏，剃除，剃除结缔组织结缔组织和脂肪，用和脂肪，用5ml5ml无血清培养液冲洗一次；无血清培养液冲洗一次；(3)(3)把脾把脾脏脏置于已消毒的置于已消毒的9090一一100100目不目不锈钢锈钢网或尼网或尼龙纱龙纱网中；网中；(4)(4)在脾中部切开一小口，用注射器芯从一端在脾中部切开一小口，用注射器芯从一端轻轻压挤轻轻压挤，再用无血清培养液冲洗，再用无血清培养液冲洗，令令细细胞通胞通过纱过纱网，收集入平皿中，或用注射器向脾网，收集入平皿中，或用注射器向脾脏脏内注入内注入3ml3ml无血清培养无血清培养 液，反复抽吸数次方法液，反复抽吸数次方法获获取取细细胞，再制成胞，再制成细细胞胞悬悬液亦可；液亦可；(5)(5)把把细细胞胞悬悬液注入液注入50ml50ml离心管中，加离心管中，加l0l0一一20ml20ml培养液：培养液：轻轻轻轻吹打数次，室温中吹打数次，室温中 置置5 5分分钟钟；(6)(6)离心离心(800(800一一10001000转转分分)计计数、数、备备用。用。54.（四）（四）细细胞准胞准备备（1 1）收集骨髓瘤）收集骨髓瘤细细胞，用无血清培养液洗胞，用无血清培养液洗3 3次次(37)(37)，计计数活力数活力细细胞胞(不少于不少于9090)；（2 2）收集小鼠脾）收集小鼠脾细细胞，用无血清培养液洗胞，用无血清培养液洗3 3次次(37)(37)，并，并计细计细胞数和胞数和测测定活力定活力细细胞；胞；（3 3）按）按1 1：5 5或或1 1：1010混合脾混合脾细细胞和骨髓瘤胞和骨髓瘤细细胞后，离心弃去上清，并以消毒胞后，离心弃去上清，并以消毒滤滤 纸纸吸吸 净净多余上清。多余上清。55.（五）（五）细细胞融合胞融合(1)将1ml 40的PEG液一滴滴加入列细胞团中，在60秒内加完，同时并不断轻微 转动离心管或用手指轻弹离心管；(2)在不断转动离心管中加1ml无血清培养液，60秒钟内加完；(3)于5分钟内慢慢加完20ml无血清培养液；此时细胞对机械损伤非常敏感，(4)离心(800转分，8分钟)，去上清，用完全培养液10ml悬浮，轻轻混匀；(5)取96孔板，每孔加50l；(6)取等体积细胞悬液，向另一96孔板中加50P1；(7)送入5CO2，温箱中37培养，24小时后更换成HAT选择性培养掖。56.（六）融合后（六）融合后细细胞培养胞培养(1)融合后710天用HAT培养液半量换液(留一半旧的加一半新的)后每隔23天 半量换液一次；(2)两周后可改用HA培养液半量换液，或仍用HAT培养液；(3)23周后出现杂交细胞集落，细胞个大、圆且透明；(4)待集落增殖生长至13孔时，应进行抗体检测。57.HAT培养基培养基次黄嘌呤（hypoxanthine，H）氨基喋呤（aminopterin，A）胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidine，T）次黄次黄嘌嘌呤呤鸟鸟嘌嘌呤呤转转磷酸核糖激磷酸核糖激酶酶缺陷型（缺陷型（HGPRT-）胸腺胸腺嘧啶嘧啶核苷激核苷激酶酶缺陷型（缺陷型（TK-）58.本章小本章小结结u细胞融合又称体细胞杂交，是两个或更多个相同或不同细胞通过膜 融 合形成单个细胞的过程。u细胞融合的方法主要有生物法（仙台病毒法）、化学法（聚乙二醇 法）和物理法（电融合法）。u杂合细胞的筛选方法主要有基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立的杂 种筛选、基于营养缺陷型细胞所建立的杂种筛选、由温度敏感型细胞 组成的杂种细胞的筛选及具有所需性状杂种细胞的筛选。u基于细胞融合的杂交瘤技术和单克隆抗体技术具有广泛的应用价值。59.