基质辅助激光解吸电离质谱成像技术及其在食品分析中的应用.pdf
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1、2982018, V ol.39, No.07食品科学专题论述基质辅助激光解吸电离质谱成像技术及其在食品分析中的应用殷小钰,陈倩,韩齐,孔保华*(东北农业大学食品学院,黑龙江 哈尔滨 150030)摘 要:基质辅助激光解吸电离质谱成像( matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry imaging,MALDI-MSI)技术是一种新型的分析技术,具有无需提取、分离、纯化待测样品,操作简便、灵敏度高等优点,广泛应用于生物、医学等领域。虽然其在食品领域还未建立完善的测定方法,但由于该技术可对食品中的化合物进行空间成像分析,
2、故其在食品领域中也将具有广阔的应用前景。本文在介绍 MALDI-MSI技术成像原理的基础上,综述了该技术的样品制备和在食品成分分析中的应用,并对其应用前景进行了展望,以期为 MALDI-MSI技术在食品研究中的应用和推广提供借鉴。关键词:基质辅助激光解吸电离质谱成像;食品分析;成像原理;样品制备;应用A Review of the Application of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry Imaging in Food AnalysisYIN Xiaoyu, CHEN Qian, HAN Qi, K
3、ONG Baohua*(College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin150030, China)Abstract:Abstract: Matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry imaging (MALDI-MSI), a new analytical technique,is widely used in biological, medical and other fields due to its usefulness fo
4、r the detection of compounds without extraction,purification, separation, or labeling. Although the methodology of MALDI-MSI in food science is not yet fully established,its application is expected to open up a new insight in food science. In this paper, the principle of MALDI-MSI imagingis describe
5、d and its application in sample preparation and food analysis is reviewed. Future prospects for MALDI-MSIapplication are also discussed. We expect that this review which will provide a basis for the application and popularization ofMALDI-MSI in food analysis.Keywords:Keywords: matrix-assisted laser
6、desorption ionization mass spectrometry imaging; food analysis; imaging principle; samplepreparation; applicationDOI:10.7506/spkx1002-6630-201807044中图分类号:TS207.3文献标志码:A引文格式:殷小钰, 陈倩, 韩齐, 等. 基质辅助激光解吸电离质谱成像技术及其在食品分析中的应用 J. 食品科学, 2018, 39(7):298-304. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201807044. http:/YIN Xiaoyu
7、, CHEN Qian, HAN Qi, et al. A review of the application of matrix-assisted laser desorption ionizationmass spectrometry imaging in food analysisJ. Food Science, 2018, 39(7): 298-304. (in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-201807044. http:/文章编号:1002-6630(2018)07-0298-07基质辅助激光解吸电离
8、质谱成像(matrix-assistedlaser desorption mass spectrometry imaging,MALDI-MSI)技术是利用MALDI质谱技术,通过质谱仪测定离子的质荷比( m/z)来分析生物分子的标准分子质量,并结合专门的质谱成像软件辅助产生分子图像的新型分析技术。该技术最早于 1997 年由Caprioli 和同事一起提出1。同传统的分析技术相比, MALDI-MSI 技术无需提取、分离、纯化待测样品,具有检测分子质量范围广、灵敏度高、操作简便、自动化水平高等特点2。随着MALDI-MSI 技术的发展,其已被广泛应用于生命科收稿日期:2017-01-15基金
9、项目:国家重点基础研究发展计划( 973计划)项目( 2016YFD0401504);黑龙江省应用技术研究与开发计划项目(GA15B302 )第一作者简介:殷小钰(1993),女,硕士研究生,研究方向为畜产品加工工程。E-mail:*通信作者简介:孔保华(1963),女,教授,博士,研究方向为畜产品加工。E-mail:专题论述食品科学2018, V ol.39, No.07299学领域,如动植物生理学3、病理学4、药物研发及疗效监控5等。基于MALDI-MSI 技术的诸多优点,近几年来其在食品科学领域中也得到了应用6。本文主要介绍MALDI-MSI技术样品制备及其在食品分析中的应用,并对其发展
10、方向进行了展望。1 MALDI-MSI1 MALDI-MSI的成像原理MALDI-MSI 技术需要使用冰冻切片机对被研究的组织进行切片处理,获得极薄的组织切片后用基质进行覆盖,然后将干燥结晶后的切片组织置于质谱仪的靶上进行成像分析。该技术的原理是以软电离技术 MALDI为基础,将分析物分散在基质分子中并形成晶体。用紫外(ultra-violet ,UV)和红外(infrared,IR)的激光束照射晶体时,由于基质分子经辐射所吸收的能量蓄积并迅速产热,基质晶体升华,进而使样品从表面解吸进入气相,基质和分析物发生膨胀,进行气相质子交换反应形成离子7。然后利用MALDI系统的质谱成像软件分析样品组织
11、,将质谱仪所获得的样品上每个点的 m/z信息转化为照片上的像素点。在每个样品点上,将所有质谱数据经平均化处理获得一幅代表该区域内化合物分布情况的完整质谱图。仪器逐步采集质谱数据,最后得到具有空间信息的整套样品的质谱数据,完成对组织样品的“分子成像”。设定m/z的范围,即可确定该组织区域所含生物分子的种类,选定峰高或者峰面积来代表生物分子的相对丰度8。一般通过质谱成像可获取组织切片的二维图谱,在组织发育的过程中,将用连续切片获取的二维图谱组合,可绘出样品组织中靶分子的三维图谱,以分析其空间结构9。MALDI-MSI的工作流程如图1所示10。ABCDE100Fhv80604020025507510
12、0125A.样品制备;B.使用冰冻切片机切割薄片; C.覆盖基质;D. 使用具有MALDI源的质谱仪进行数据采集;E. 每个位置产生的质谱; F. 图像生成和分析。图 1 1典型MALDI-MSIMALDI-MSI组织分析的工作流程1010Fig. 1Fig. 1Typical MALDI-MSI workflow for tissue analysisTypical MALDI-MSI workflow for tissue analysis10102 MALDI-MSI2 MALDI-MSI样品制备MALDI-MSI技术的关键在于样品的制备方法和基质的选择。对于植物组织和动物组织, MAL
13、DI-MSI技术的样品制备方法已经逐渐成熟,因此,在食品分析中,肉类样品处理方法可参照哺乳动物组织进行处理,蔬菜和水果样品可参照植物组织进行处理。2.1样品组织的收集及贮藏在MALDI-MSI成像中,样品的质量对内部化合物的分布有很大的影响,并且由于样品不能直接用来成像,因此,样品的处理和贮藏是能否获得高质量图像的关键因素。样品的收集和处理的过程一定要快速,因为组织一旦被分离,其内部物质就会发生降解。一般情况下将样品冻藏一段时间,直至分析前取出,样品的贮存时间取决于样品的性质,但是在样品的贮藏期间也要考虑分析物质的降解和迁移11。还有研究人员将样品放在液氮或干冰与不同溶剂混合的低温浴中快速冷冻
14、,但不建议直接将样品放入液氮中,以免组织发生断裂或破碎。Schwartz等12将新鲜的组织放入到塑料试管中以避免这种情况的发生。也有研究人员建议采用 70 下的乙醇和异丙醇来代替液氮13。2.2切片在用冰冻切片机切片时,需要用支持物对样品进行包埋,为切片提供支持。形状较规则的大样品可以用少量的去离子水直接固定在切片机试样夹里,但是较小的样品则需要用支持物进行包埋14。常用的支持物有石蜡、冰、质量分数10%明胶和羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose,CMC)溶液等15。在食品分析中,切片的厚度取决于样品性质和仪器的限制。一般情况下,组织切片的厚度为1020 m16。近年来
15、也有研究人员发现,在分析高分子质量的物质(321 kDa)时,用25 m厚度的样品切片可以获得高质量的图像17。切片之后,通过融裱或双面胶带将样品转移到质谱成像的靶上。2.3组织预处理2.3.1组织切片的冲洗通常,在用基质覆盖之前,最好洗涤或漂洗组织切片,除去一些抑制目标分子电离的内源分子和盐,加重信号,以免产生复杂的图谱。也有研究人员认为,组织切片冲洗前须在真空或氮气中脱水,减少湿度对分析的影响。一般情况下使用酒精来清洗切片。对于脂肪含量较高的组织,一般用氯仿或二甲苯等溶液进行清洗。Enthaler 等18研究表明,组织切片的冲洗会导致切片中蛋白质含量大幅降低。因此,在清洗过程中应避免除去一
16、些成像的目标小分子,以获得高质量的图谱。另一种组织切片的洗涤方法是用溶剂湿润的无纤维纸局部清洗组织切片19。这种局部清洗的方法适用于易碎的组织切片,可以用来对比清洗区域和未清洗区域。2.3.2切片组织消化利用MALDI-MSI技术分析蛋白质时,由于该技术具3002018, V ol.39, No.07食品科学专题论述有探测上限,无法探测大分子蛋白质,因此在对大分子蛋白质分析前,需要对其进行组织消化获得小肽段20。随后,再通过 MALDI-MSI 技术用得到的小肽段的空间信息定位母蛋白质。组织消化是利用蛋白酶处理组织切片,产生多个小肽段。由于MALDI-MSI技术可鉴定蛋白酶水解后的小肽段,因此
17、MALDI-MSI技术也适用于鉴定分析未知的蛋白质。2.4基质的选择及覆盖方法2.4.1基质的选择在MALDI成像中,基质的类型和覆盖方法是获得高质量可重复的离子图像的关键21。由于激光束的不同,MALDI-MSI可分为紫外质谱成像(UV-MALDI-MSI)和红外质谱成像(IR-MALDI-MSI ),与UV-MALDI-MSI相比,IR-MALDI-MSI的主要优点是样品中的内源水可以作为基质吸收红外辐射。但是,在分析的过程中,灵敏度可能会因为水分的不均匀分布而发生变化22。在利用UV-MALDI-MSI 对食品成分分析时,常用的基质为2,5-二羟基苯甲酸( 2,5-dihydroxybe
18、nzoic acid,DHB)、芥子酸(sinapinic acid ,SA)和-氰基-4-羟基苯丙烯酸(-cyano-4-hydroxycinnamic acid ,CHCA),其中,SA主要适用于高分子质量的蛋白质,在分子质量约为 4 kDa 的高分子化合物(如蛋白质和肽)的分析中,SA可以提供更好的信噪比23。Cavatorta 等24利用MALDI-MSI 技术分析桃中的变应原时,选择了SA作为基质,获得了高质量的图谱。DHB 、9-氨基吖啶(9-aminoacridine ,9-AA)和CHCA适用于分析低分子质量的物质。另外,基质混合物的应用可以改善电离效率和信号强度23。Lema
19、ire 等11在MALDI-MSI 中,使用CHCA-二甲基苯胺混合液作为基质复合物,研究发现相比于单独使用 CHCA,CHCA-二甲基苯胺基质复合物形成了致密且均匀的基质层,其信号强度更高。2.4.2基质的覆盖方法基质对分析物的覆盖方法是能否获得高质量图谱的重要因素,其方法大致可分为湿法和干法。用于湿法覆盖分析物的设备有手动式气喷雾器、压电高频振动基质喷雾器、声控微滴喷射器和化学打印喷射器25。其中手动式喷雾器是最早也是最常用于基质喷涂的工具,该方法简单易行,但是人工操作会导致每次喷雾的均匀度不一致,因此,获得均匀的基质涂层很大程度上依赖于操作者的熟练程度26。湿法覆盖分析物应该在喷雾和干燥
20、反复循环的条件下操作,每次喷雾要达到刚好润湿切片的效果。根据组织表面性质的不同,循环次数一般为310 次。基质干燥涂层法是将基质和样品一同放在真空室里,加热基质,冷却样品,使基质直接升华到冷却后的样品上,大大降低了分析物的离域。然而,对于需要掺入基质晶体中的分析物,其信号强度相对较差27。3 MALDI-MSI3 MALDI-MSI在食品成分分析中的应用食物中含有碳水化合物、脂质和蛋白质等营养成分,有些食物还含有一些内源性毒素。对这些成分进行常规的化学方法分析时操作步骤繁琐,需要提取、分离分析物质,然后采用高效液相色谱法、气相色谱 -质谱联用法等进行分析。而MALDI-MSI技术作为一种快速高
21、效的分析技术,可以克服这些缺点,近些年在食品分析中得到了应用。3.1对食品中碳水化合物的分析碳水化合物在生命活动过程中起着重要的作用,是生物体维持生命活动所需能量的主要来源,可分为单糖、二糖、寡糖和多糖。水果和蔬菜中的糖类主要有蔗糖、葡萄糖、果糖等,这3 种成分的含量在不同水果和蔬菜中是不同的。在草莓、香蕉、葡萄、西红柿和茄子的组织切片中呈现出多样化的空间分布28-29。Li Yue等28利用MALDI-MSI技术在草莓的表皮组织和种子中发现了丰富的蔗糖(图2)。蔗糖是碳素同化物的主要转移形式,也是植物器官的碳骨架和无法进行光合作用时器官的能量来源。Berisha等30利用MALDI-MSI技
22、术探索葡萄的外果皮和种子中糖类的空间分布,发现单糖主要分布在葡萄的外果皮中,而二糖主要分布在中果皮里。目前,质谱成像技术在碳水化合物中的应用主要集中在单糖和二糖等糖类的检测6,而在一些化学结构复杂的碳水化合物实验中还存在着许多问题。通过MALDI-MSI技术获得的碳水化合物的空间分布信息有助于我们探索水果和蔬菜中碳水化合物的生物合成和代谢途径,控制果蔬在贮藏与加工过程中营养成分的变化,以保持和改善果蔬及其加工制品的感官品质。A500 mB43mm/2y1001234x/mm专题论述食品科学2018, V ol.39, No.07301C43mm/2y1001234x/mmD43mm/2y100
23、1234x/mmA.草莓表皮与嵌入的种子; BD.分别为蔗糖、葡萄糖/果糖、柠檬酸的 IR-MALDI-MSI 图像。图 2 2草莓表皮与嵌入的种子周围的 3 3 个主要成分的MALDI-MSIMALDI-MSI图像2828Fig. 2Fig. 2Optical image of a strawberry skin compared to MALDI-MSIOptical image of a strawberry skin compared to MALDI-MSIimages for three major components around embedded seedsimages fo
24、r three major components around embedded seeds28283.2对食品中脂质的分析脂质是生物体内一大类微溶于水、溶于有机溶剂的物质,它的种类和品质的好坏直接影响着食品的风味、质地和颜色。尤其是肉制品,在不良的条件下进行贮藏极易发生氧化。脂质氧化会生成低级脂肪酸、醛、酮等物质,它们具有刺鼻的不良气味,影响肉类的风味、质地、颜色和营养。因此控制和减少脂质氧化是肉类食品科学中研究的重点。传统的分析手段可以实现对脂质含量、分布及氧化程度的分析,但是在脂质提取过程中物质的分布信息会有所缺失,无法达到分子水平。而MALDI-MSI技术通过添加基质保护促进了样品的电
25、离。Dyer等31首先根据脂质在质谱中的相对丰度,确定出磷脂、甘油三酯和胆固醇为标记物,随后利用 MALDI-MSI技术绘制了脂质氧化降解产物的空间分布图,研究了不同的包装条件(高氧、空气和真空)对牛背最长肌在贮藏期间脂质氧化的影响。2 mm图 3 3牛背最长肌中磷脂酰胆碱(m m/z z 760.6 760.6)和未确定脂质(m m/z z 428.2 428.2)的离子强度的空间异质性3131Fig. 3Fig. 3Observed spatial heterogeneity of the ion intensities of aObserved spatial heterogeneity
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- 基质 辅助 激光 解吸 电离 成像 技术 及其 食品 分析 中的 应用
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