最新双向电泳蛋白样品的制备PPT课件.ppt
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1、双向电泳蛋白样品的制备双向电泳蛋白样品的制备一、蛋白质提取原则:、蛋白质提取原则:二、样本裂解方式:二、样本裂解方式:三、三、2D2D蛋白裂解液组成及作用:蛋白裂解液组成及作用: 1:裂解液组成及作用 2:常见裂解液四、蛋白质提取步骤:四、蛋白质提取步骤:五、蛋白质样本制备实例:五、蛋白质样本制备实例: 1:动物组织样本制备 2:植物组织样本制备六、样本制备试剂:六、样本制备试剂:双向电泳样品制备:双向电泳样品制备: 辉骏生物:辉骏生物:http:/ 免费服务热线:免费服务热线:400-699-16633 3、还原剂:、还原剂: (1) 作用:断裂蛋白质中的二硫键,以利于肽链的分离。 (2)
2、分类: -巯基乙醇,二硫苏糖醇(DTT),二硫赤藓糖(DTE) a: 其中DTT带有电荷,在等点聚焦时,常常会迁移到PH范围 以外,从而使某些蛋白质的二硫键重新配对,使溶解度降低而重新沉淀下来。使用浓度范围10100 mmol/L. b: 采用非离子还原剂三丁基膦TBP可以大大增加蛋白质的溶解性,并利于蛋白从第一向转移到第二向。但是TBP在水溶液中的不稳定性和不溶性,使其在第一向IEF中维持蛋白质还原状态是相对无效的。因此在IEF时建议最好使用巯基还原剂。三、双向电泳样本制备裂解液组成及作用三、双向电泳样本制备裂解液组成及作用 辉骏生物:辉骏生物:http:/ 免费服务热线:免费服务热线:40
3、0-699-1663种类种类作用作用PMSF不可逆地抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶EDTA,EGTA 可逆的蛋白酶抑制剂(如亮抑蛋白酶肽,胃蛋白酶抑制剂)多肽蛋白酶抑制剂 逆的蛋白酶抑制剂(如亮抑蛋白酶肽,胃蛋白酶抑制剂)磷酸酶抑制剂抑制磷酸酶活性Benzamidine抑制丝氨酸蛋白酶。4 4、蛋白酶抑制剂的种类及作用:、蛋白酶抑制剂的种类及作用:三、双向电泳样本制备裂解液组成及作用三、双向电泳样本制备裂解液组成及作用 辉骏生物:辉骏生物:http:/ 免费服务热线:免费服务热线:400-699-1663 1、 提取前准备: (1): 提取总蛋白,亚细胞蛋白; (2): 裂解细胞的方式选择; (3
4、): 裂解液的选择。 2、 加入裂解液,冰上放置一段时间。 3、 离心去沉淀,收集上清蛋白。 4、 用于二维电泳时,考虑是否有必要除去干扰物质,如核酸, 脂类,盐等。三、双向电泳样本制备简要实验步骤三、双向电泳样本制备简要实验步骤 辉骏生物:辉骏生物:http:/ 免费服务热线:免费服务热线:400-699-1663五、双向电泳样本制备实例五、双向电泳样本制备实例动物样本动物样本 (1 1)将组织切细后置于研钵中,迅速加入液氮进行研磨,直至组织变成粉末,均匀而没有明显颗粒即可。 (2 2)在研钵中加入800LB(使用前加入1 PMSF),充分溶解(收集)粉末后转移至1.5mLEP管中,4,12
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