ABI 3500xL基因分析仪操作流程.doc
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1、ABI 3500xL基因分析仪操作流程一、 标准测序反应(一) 质粒测序标准实验流程1对质粒DNA的质量和浓度要求 纯度:OD 260/OD 280= 1.62.0,用量:每反应150300 ng。2测序 PCR 反应 标准反应体系:3测序产物纯化:使用Edge Bio收集柱进行纯化。(1)离心850g,3min柱子,弃掉收集管,换新的EP管。(2)将待纯化样品加到柱子中间,注意不要加到离心柱侧壁上。(3)离心850g,3min,弃掉柱子,即得纯化产物。(4)取10 L Hi-Di Formamide加入96孔板中,再加入10 L待测样品,振荡混匀离心。(二) PCR 产物测序标准实验流程1
2、对PCR 产物的要求纯度:OD 260/ OD280=1.62.0,用量:每反应10100 ng。强烈建议在测序前,先纯化PCR产物。2 PCR产物的测序 PCR 反应标准反应体系:3 测序产物纯化:方法同上。二、 上机测序(一)启动系统1. 打开电脑,检查电脑右下角处3500监控状态是否正常启动。2. 打开3500 xL仪器电源,等待仪器自检,指示灯由黄色变为绿色即为自检完成。3. 启动电脑桌面Data collection software。4. 检查维护提醒:浏览维护提醒,若已完成点击。5. 检查耗材状态:点击“Refresh”,更新后检查仪表盘上各种耗材的状态(POP7、ABC、CBC
3、和毛细管),若指示针在可用范围内则可继续,若在指示针在红色区域中,则需更换耗材后再继续。6. 仪器预热:点击仪表盘上的“Start Pre-heat”按钮预热炉子和泳道。(二)放置待测样品1. 检查确保橡胶隔板均通透后,将其小心盖在加有待测样品的96孔板上,注意孔对孔盖好。2. 将板子放入板架中,盖好固定盖,确保所有孔都一一对齐,即组装好测序板子。3. 按仪器的TRAY按钮,使托盘出仓,之后将组装好的板子放入自动采样器中,注意有标记的一侧面对操作者。(三)创建平板1. 点击Create Plate From Template,在弹出对话框中选择模板Std_Seq_Array_xL_POP7,点
4、击Open,输入详细的平板信息,包括Name, Number of Wells, Plate Type, Capillary Length, Polymer。一般详细如下。1. 点击屏幕下方的Assign Plate Contents。(1) 输入各个孔的样品名称等信息,Results group:输入结果的保存路径。(2) 选中下面控制面板上Assay,Filename convention,Results group三个项目。(3) 点击Link Plate for RunOK。2. 检查屏幕上显示的各种信息,确定正确无误后点击Start Run,即启动运行。(四)监控运行仪器正在运行时,
5、可在软件中监控运行情况。1. 可查看选中的单孔或某一排的运行情况,查看Instrument Run Views and Flags中各项:EPT(电流、电压、温度),Array中可查看峰图。2. 可编辑进样列表:重复进行,改变次序,删除进样,终止进样等操作。3. 启动、暂停或继续运行。(五)查看结果点击Review Results即可查看原始的测序结果,分析结果方法见下。三、 分析测序结果1. 打开软件:双击电脑桌面Sequencing Analysis v5.4图标。2. 导入结果:点击工具栏中Add samples 按钮,选择路径,导入待分析的测序结果。3. 分析:Sample manag
6、er中选择分析方法对测序结果进行分析。一般用BC (baseclling, 将原始结果翻译为对应的碱基序列)。(1) 选中BC复选框,点击工具栏中Start analysis 按钮,即开始分析。(2) 分析结束后,结果将自动保存为ab1格式文件。(3) 点击工具栏中Analysis report 按钮,可查看结果状态(BC status),不同颜色代表不同测序结果,可判定本次测序成功与否。(4) 选中某样品前show复选框,即可查看各样品的详细结果。A sequence显示碱基序列及其QV评分结果。注意:a. 蓝色:High QV = 20+,结果可信;黄色Medium QV = 15 to
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