细胞转染简介.ppt
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1、关于细胞转染简介现在学习的是第1页,共40页报告内容报告内容 一一 转染的简介转染的简介 二二 转染的分类转染的分类 三三 转染的方法转染的方法 四四 转染后筛选转染后筛选现在学习的是第2页,共40页一一、转染的简介转染的简介 1.基因转染基因转染:将具生物功能的核酸转移或运将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能。物功能。2.基因转染技术已广泛应用于基因组功能研基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究和基因治疗研究。究和基因治疗研究。现在学习的是第3页,共40页二二 、转染的分类转染的分类瞬时转染瞬时转染稳定转染稳定转染目的目的快速分
2、析快速分析为获得稳定表达外为获得稳定表达外源基因的单细胞克源基因的单细胞克隆隆 目的目的DNA与宿主与宿主染色体染色体未整合未整合整合整合表达持续时间表达持续时间随细胞分裂而稀释随细胞分裂而稀释至丢失至丢失4872小时小时 随宿主细胞本身基随宿主细胞本身基因组一样复制,转因组一样复制,转录,翻译,并被稳录,翻译,并被稳定遗传定遗传 筛选办法筛选办法抗生素抗性抗生素抗性抗生素抗性抗生素抗性现在学习的是第4页,共40页三、转染的方法三、转染的方法 基因转染的基本方法可以分为:基因转染的基本方法可以分为:(1)重组子的构建)重组子的构建(2)基因转染真核细胞的方法)基因转染真核细胞的方法现在学习的是
3、第5页,共40页重组子的构建重组子的构建1.目的基因的制备和获取目的基因的制备和获取2.哺乳动物细胞表达载体的选择哺乳动物细胞表达载体的选择3.DNA片断的重组连接片断的重组连接4.DNA重组体的鉴定重组体的鉴定现在学习的是第6页,共40页1.目的基因的制备和获取目的基因的制备和获取(1)目的基因目的基因 是所要研究或应用的基因,也就是将要是所要研究或应用的基因,也就是将要克隆或表达的基因或基因的一个片段克隆或表达的基因或基因的一个片段(2)目的基因常用的制备方法目的基因常用的制备方法现在学习的是第7页,共40页 A.限制酶切除限制酶切除 a.从原核基因组从原核基因组DNA制备视原核基因制备视
4、原核基因组物理图谱已知或未知,克隆方法不同。组物理图谱已知或未知,克隆方法不同。b.从真核基因组从真核基因组DNA制备制备 c.从已克隆的从已克隆的DNA片段制备片段制备现在学习的是第8页,共40页B.B.PCRPCR或或RT/PCRRT/PCR方法制备目的基因方法制备目的基因a.获取已知基因获取已知基因 据已发表的基因序列(或基因两侧序列已知)据已发表的基因序列(或基因两侧序列已知)设计设计/合成一对引物合成一对引物 PCRPCR(基因组(基因组DNADNA为模板)为模板)/RT-PCR(mRNA/RT-PCR(mRNA为模板为模板)从组织或细胞制备目的基因从组织或细胞制备目的基因b.b.构
5、建构建RT/PCRRT/PCR文库法获取未知基因文库法获取未知基因 据据mRNAmRNA末端如末端如polyApolyA尾设计共同引物尾设计共同引物 将所用将所用mRNAmRNA并并逆转录成逆转录成cDNAcDNA利用工具酶在利用工具酶在cDNAcDNA末端加尾末端加尾 采用一对共用采用一对共用引物扩增所有引物扩增所有cDNAcDNA,插入适当载体,插入适当载体 构成构成PCRcDNA文文库筛选库筛选现在学习的是第9页,共40页C.计算机克隆计算机克隆即利用即利用GenBank信息,利用不信息,利用不同种属同源性设计引物,尝试获取未知基因同种属同源性设计引物,尝试获取未知基因片段,这有赖于各种
6、计算机软件的应用。片段,这有赖于各种计算机软件的应用。D.化学合成法制备基因片段化学合成法制备基因片段用用DNA合成仪,合成仪,对目的基因分段合成,连接,可以得到所需对目的基因分段合成,连接,可以得到所需的目的基因。的目的基因。现在学习的是第10页,共40页2.哺乳动物细胞哺乳动物细胞表达载体的选择表达载体的选择哺乳动物细胞表达载体有哺乳动物细胞表达载体有2大类:质粒型载体和病毒型载大类:质粒型载体和病毒型载体体(1)质粒型载体)质粒型载体 哺乳动物细胞质粒型载体大多数是通过细菌质粒而获得的,哺乳动物细胞质粒型载体大多数是通过细菌质粒而获得的,主要是在质粒的基础上插入了一些病毒或其他一些物种及
7、人主要是在质粒的基础上插入了一些病毒或其他一些物种及人的基因表达调控序列。的基因表达调控序列。A.典型的哺乳动物细胞表达载体需要以下顺式作用元件典型的哺乳动物细胞表达载体需要以下顺式作用元件:a.启动子启动子 b.增强子增强子 c.多聚腺苷酸化信号多聚腺苷酸化信号 d.药物选择标记基药物选择标记基e.报告基因报告基因 f.表位标签表位标签现在学习的是第11页,共40页B.B.常用的哺乳动物表达质粒载体常用的哺乳动物表达质粒载体a.pcDNA3.la.pcDNA3.lb.pSIb.pSIc.pCMV-HAc.pCMV-HAd.pBudCE4.1d.pBudCE4.1e.pTREe.pTRE现在学
8、习的是第12页,共40页2 2)病毒型载体)病毒型载体 病毒型载体已被广泛地用于将外源基因导入哺乳动物病毒型载体已被广泛地用于将外源基因导入哺乳动物细胞或替换哺乳动物细胞中的缺陷基因,这类载体将来在基细胞或替换哺乳动物细胞中的缺陷基因,这类载体将来在基因治疗中将具有非常重要的价值。目前应用的病毒类型包括:因治疗中将具有非常重要的价值。目前应用的病毒类型包括:逆转录病毒、腺病毒、牛痘病毒和杆状病毒等。逆转录病毒、腺病毒、牛痘病毒和杆状病毒等。A A逆转录病毒载体逆转录病毒载体 逆转录病毒的优点是,可以使外源基因整合到基因组中,逆转录病毒的优点是,可以使外源基因整合到基因组中,因而可以被稳定传代和
9、表达。但是,由于逆转录病毒的插入位点因而可以被稳定传代和表达。但是,由于逆转录病毒的插入位点是随机的,因而在基因组内的整合有可能破坏一些内源基因的结是随机的,因而在基因组内的整合有可能破坏一些内源基因的结构,尤其是当插人到一些重要的基因位点时会导致细胞的异常。构,尤其是当插人到一些重要的基因位点时会导致细胞的异常。现在学习的是第13页,共40页B.腺病毒载体腺病毒载体 易于培养、纯化,在感染过程中复制与易于培养、纯化,在感染过程中复制与转录依赖于宿主细胞的聚合酶,可插入较转录依赖于宿主细胞的聚合酶,可插入较大的外源基因片段,且腺病毒基因不会发大的外源基因片段,且腺病毒基因不会发生整合,是研究真
10、核基因的良好模型。生整合,是研究真核基因的良好模型。现在学习的是第14页,共40页3.DNA片断的重组连接片断的重组连接粘端连接方法要点粘端连接方法要点平端连接方法要点平端连接方法要点单酶单切点单酶单切点 防自身环化,防自身环化,希望定向插入;希望定向插入;双酶双切点双酶双切点 定向克隆,构定向克隆,构建表达载体的最好用此法;建表达载体的最好用此法;利用同裂解酶产生相同粘端利用同裂解酶产生相同粘端。平端,平端连接;平端,平端连接;Linker连接酶切产生粘端连接;连接酶切产生粘端连接;Adaptor衔接目的基因和载体;衔接目的基因和载体;同源同聚尾,克隆同源同聚尾,克隆cDNA的最好方的最好方
11、法法T载体,载体,PCR产物产物T/A克隆克隆法连法连接接现在学习的是第15页,共40页4.DNA重组体的鉴定重组体的鉴定外源外源DNA片断是否插入载体构成重组片断是否插入载体构成重组DNA分子,而插入片分子,而插入片断大小,是否突变及插入位置,顺序及方向则关系到断大小,是否突变及插入位置,顺序及方向则关系到构建载体是否扩增,我们所需要的基因或表达,表达构建载体是否扩增,我们所需要的基因或表达,表达相应的产品,所以需要进一步鉴定相应的产品,所以需要进一步鉴定DNA重组体重组体(1)酶切鉴定是必需的,基于下述酶切鉴定是必需的,基于下述:A.限制性图谱个体特异性,不同的载体或限制性图谱个体特异性,
12、不同的载体或DNA分分子物理图谱不同,酶切后片段大小不一样,电泳图子物理图谱不同,酶切后片段大小不一样,电泳图谱不一样。谱不一样。B.同一载体连接不同的同一载体连接不同的DNA片断,不同的载体连接同片断,不同的载体连接同一片段一片段(片段上也有位点)酶切图谱是不同的片段上也有位点)酶切图谱是不同的。现在学习的是第16页,共40页C.插入法插入法(单酶单切点单酶单切点)或替代法或替代法(双酶双位点双酶双位点)酶切,一般来说用酶切,一般来说用3种限制酶切:种限制酶切:可鉴定载体及可鉴定载体及 插入片段的大小插入片段的大小,方方向向,切后并电泳分析切后并电泳分析,以确定是否得到预期以确定是否得到预期
13、的的rDNArDNA。2)若构建)若构建DNA重组体是为了克隆某个基因,重组体是为了克隆某个基因,可进行在序列测定。可进行在序列测定。(3)若构建表达载体,可进行表达产物鉴定。)若构建表达载体,可进行表达产物鉴定。现在学习的是第17页,共40页基因转染真核细胞的方法基因转染真核细胞的方法转染方转染方 法法化学化学 转染法转染法物理物理 转染法转染法病毒病毒 感染法感染法DEAE一一葡聚糖葡聚糖 法法显微显微注射注射 法法逆转录病毒逆转录病毒磷酸钙磷酸钙 法法电穿孔电穿孔 法法腺病毒腺病毒人工人工脂质体脂质体 法法基因枪基因枪 法法现在学习的是第18页,共40页(1).DEAE-(1).DEAE
14、-葡聚糖葡聚糖 是最早应用哺乳动物细胞转染的试剂之是最早应用哺乳动物细胞转染的试剂之一。一。DEAE-DEAE-葡聚糖是阳离子多聚体葡聚糖是阳离子多聚体,它与带它与带负电的核酸结合后接近细胞膜而被摄取。负电的核酸结合后接近细胞膜而被摄取。DEAEDEAE一葡聚糖转染已成功地应用于瞬时开一葡聚糖转染已成功地应用于瞬时开始,但用于稳定转染却不可靠。始,但用于稳定转染却不可靠。现在学习的是第19页,共40页(2).(2).磷酸钙共沉淀转染法磷酸钙共沉淀转染法 由于试剂易得、价格便宜而被广泛用于由于试剂易得、价格便宜而被广泛用于瞬时转染和稳定染的研究。方法是,先将瞬时转染和稳定染的研究。方法是,先将D
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