核酸扩增技术精选PPT.ppt
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1、目目 录录关于核酸扩增技术第1页,讲稿共98张,创作于星期二目目 录录大纲要求:大纲要求:n掌握掌握PCRPCR的原理和反应过程的原理和反应过程n掌握掌握PCRPCR反应体系反应体系n掌握掌握PCRPCR产物产物的检测的检测n熟悉实时荧光定量熟悉实时荧光定量PCRPCR的原理和方法的原理和方法n了解了解以以PCRPCR为基础的相关技术为基础的相关技术Special第2页,讲稿共98张,创作于星期二目目 录录二、教学内容二、教学内容第一节第一节 聚合酶链式反应聚合酶链式反应第二节第二节 以以PCRPCR为基础的相关技术为基础的相关技术第三节第三节 PCRPCR产物的检测产物的检测第第X X节节
2、实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR现在位置现在位置 P169第3页,讲稿共98张,创作于星期二目目 录录基础知识基础知识遗传中心法则遗传中心法则现在位置现在位置 P169第4页,讲稿共98张,创作于星期二目目 录录+基础知识基础知识第5页,讲稿共98张,创作于星期二目目 录录基础知识基础知识第6页,讲稿共98张,创作于星期二目目 录录DNADNA加热变性加热变性DNADNA冷却复性冷却复性一、一、核酸分子杂交的基本原理核酸分子杂交的基本原理基础知识基础知识第7页,讲稿共98张,创作于星期二目目 录录DNA变性变性(denaturation)定义:定义:在某些理化因素作用下,在某些理化因素作用
3、下,DNADNA分子分子内碱基对之间的氢键断裂,使规则有序内碱基对之间的氢键断裂,使规则有序的双螺旋结构变为不规则无序的单链线的双螺旋结构变为不规则无序的单链线团样结构的过程。团样结构的过程。基础知识基础知识第8页,讲稿共98张,创作于星期二目目 录录基础知识基础知识第9页,讲稿共98张,创作于星期二目目 录录融解温度(融解温度(TmTm)定义:定义:在在DNADNA热变热变性时,其性时,其A260A260的的升高达最大值一升高达最大值一半时的温度。半时的温度。基础知识基础知识melting temperature,第10页,讲稿共98张,创作于星期二目目 录录DNA复性复性定义:变性的单链核
4、酸分子在一定条件下定义:变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程,称程,称复性或杂交复性或杂交。热变性的热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性,此经缓慢冷却后即可复性,此过程称为过程称为退火退火(annealing)。基础知识基础知识第11页,讲稿共98张,创作于星期二目目 录录基础知识基础知识第12页,讲稿共98张,创作于星期二目目 录录基础知识基础知识dNTPndATPndCTPndGTPndTTPdNTP第13页,讲稿共98张,创作于星期二目目 录录PCR概念:在概念:在体外体外特异地特异地复制复制一段一段已知已知序列的序列的D
5、NA片段片段的过程。的过程。第一节第一节 聚合酶链式反应聚合酶链式反应现在位置现在位置 P169第14页,讲稿共98张,创作于星期二目目 录录一、一、PCRPCR的原理和反应过程的原理和反应过程PCRPCR反应反应重复重复进行进行DNADNA复制复制的过程,使的过程,使DNADNA得得以以扩增扩增,每一次复制包括,每一次复制包括3 3个步骤:个步骤:变性变性(denaturationdenaturation)退火退火(annealingannealing)延伸延伸(extensionextension)现在位置现在位置 P125第15页,讲稿共98张,创作于星期二目目 录录变性(变性(dena
6、turationdenaturation)将待复制的双链将待复制的双链 DNADNA经经加热加热至至949495 95)左右一定时间后,)左右一定时间后,DNADNA双螺旋的双螺旋的氢键断裂,使之成为单链分子,作为反氢键断裂,使之成为单链分子,作为反应的应的模板模板(template)template),以便它与引物,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;结合,为下轮反应作准备;现在位置现在位置 P170第16页,讲稿共98张,创作于星期二目目 录录退火(退火(annealingannealing)温度降低至寡核苷酸(温度降低至寡核苷酸(oligonucleotideoligonucleotid
7、e)引物引物的的融点温度融点温度以下(以下(40407070),使),使引引物物能与能与模板模板互补结合,形成杂交链;互补结合,形成杂交链;现在位置现在位置 P125第17页,讲稿共98张,创作于星期二目目 录录延伸(延伸(extensionextension)将温度升至将温度升至7272左右,使反应体系中的左右,使反应体系中的DNADNA聚合酶聚合酶按照按照模板链的序列模板链的序列以以互补互补的方的方式依次把式依次把dNTPdNTP加至加至引物的引物的33端端,使杂交,使杂交双链不断延伸,以至形成新的双链不断延伸,以至形成新的DNA DNA 双链。双链。现在位置现在位置 P125第18页,讲
8、稿共98张,创作于星期二目目 录录PCR的基本反应过程的基本反应过程变性变性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C现在位置现在位置 P170(40-70 C)第19页,讲稿共98张,创作于星期二目目 录录PCR的扩增效率的扩增效率现在位置现在位置 P170循环次数:0123 n产物数量:2 2 2 2 20123nn每一次循环后,一分子模板被扩增为两个分子n每个循环所产生的DNA片段,即为下一个循环的模板nPCR产物量以指数形式增长第20页,讲稿共98张,创作于星期二目目 录录1.模板模板DNA2.特异性引物特异性引物3.耐热耐热DNA聚合酶聚合酶4.dNTPs5.Mg2+二、二、PCRPCR
9、体系基本组成成分体系基本组成成分现在位置现在位置 P170第21页,讲稿共98张,创作于星期二目目 录录1.模板模板DNA2.特异性引物特异性引物3.耐热耐热DNA聚合酶聚合酶4.dNTPs5.缓冲液缓冲液 二、二、PCRPCR体系基本组成成分体系基本组成成分现在位置现在位置 P170第22页,讲稿共98张,创作于星期二目目 录录模板模板(template)(template)模板模板就是将要被复制的核酸片段,包就是将要被复制的核酸片段,包括基因组括基因组DNADNA、RNARNA、质粒、质粒DNADNA和线粒体和线粒体DNADNA等。等。在用在用 RNARNA作为模板时,须先将作为模板时,须
10、先将 RNARNA逆转录逆转录为为cDNAcDNA,再以,再以cDNAcDNA作为作为PCRPCR反应反应的模板进行扩增反应。的模板进行扩增反应。现在位置现在位置 P125第23页,讲稿共98张,创作于星期二目目 录录耐热耐热DNADNA聚合酶聚合酶 Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶(Taq DNA polymeraseTaq DNA polymerase)是从一种生)是从一种生活在热泉(活在热泉(80809090)中的水栖噬热菌()中的水栖噬热菌(Thermus Thermus aquaticusaquaticus)中提取的,有很高的耐热稳定性。)中提取的,有很高的耐热稳定性。Taq
11、DNATaqDNA聚合酶的作用是聚合酶的作用是催化催化DNADNA合成合成,即在模板指导下,即在模板指导下,以以dNTPdNTP为原料,在为原料,在引物的引物的3-OH3-OH端端,加上加上dNTP,dNTP,在二者在二者间生成间生成3 3,5-5-磷酸二酯键,使磷酸二酯键,使DNADNA链沿链沿5353方方向延伸。向延伸。现在位置现在位置 P170第24页,讲稿共98张,创作于星期二目目 录录dNTPsdNTPsn即即dATPdATP、dCTPdCTP、dGTPdGTP和和dTTPdTTP四种脱氧核苷三磷酸的四种脱氧核苷三磷酸的混合物。混合物。n反应体系中反应体系中4 4种核苷酸的浓度必须一
12、致种核苷酸的浓度必须一致n四种核苷酸间浓度的不平衡会增加反应时四种核苷酸间浓度的不平衡会增加反应时DNADNA聚合酶错配的机聚合酶错配的机率。率。n浓度过高会加快反应速度,但导致非特异性扩增浓度过高会加快反应速度,但导致非特异性扩增n降低在降低在dNTPdNTP浓度会提高反应的特异性浓度会提高反应的特异性n一般为一般为20200umol/L 20200umol/L 现在位置现在位置 P170第25页,讲稿共98张,创作于星期二目目 录录镁离子浓度镁离子浓度n 镁离子浓度在扩增反应中是一个至关重要的因素,镁离子浓度在扩增反应中是一个至关重要的因素,因为镁离子对于因为镁离子对于反应系统本身反应系统
13、本身、稳定核苷酸稳定核苷酸和和提提高高Taq DNATaq DNA聚合酶的活性聚合酶的活性有直接的影响。有直接的影响。nMg2+Mg2+浓度过浓度过低低使使酶活力降低酶活力降低nMg2+Mg2+浓度过浓度过高高又会使酶催化又会使酶催化非特异性扩增非特异性扩增。n一般为一般为1.5mmol/L 1.5mmol/L 现在位置现在位置 P172第26页,讲稿共98张,创作于星期二目目 录录 引物引物(Primer)n 引物是引物是化学合成化学合成的的已知序列的寡核苷酸已知序列的寡核苷酸(oligonucleotide)分子分子。n引物决定引物决定PCR扩增扩增产物的特异性产物的特异性和和长度长度。现
14、在位置现在位置 P170第27页,讲稿共98张,创作于星期二目目 录录引物设计时必须遵循的原则(引物设计时必须遵循的原则(6 6条)条)1.用于用于PCRPCR反应的引物需要反应的引物需要二条二条,分别设在,分别设在被扩增目标片段的被扩增目标片段的二端二端,并分别与模板正,并分别与模板正负链负链序列互补序列互补。2.2.引物的长度一般以引物的长度一般以18182525个核苷酸个核苷酸为宜为宜引物过引物过长长容易产生寡核苷酸的链内互补,形成容易产生寡核苷酸的链内互补,形成发夹状结发夹状结构构,引物过引物过短短则会则会降低扩增的特异性降低扩增的特异性;现在位置现在位置 P171第28页,讲稿共98
15、张,创作于星期二目目 录录引物设计时必须遵循的原则引物设计时必须遵循的原则3.3.二条引物之间(尤其在二条引物之间(尤其在33端)的序列端)的序列不可有互补不可有互补,以免形成引物二聚体;,以免形成引物二聚体;4.4.引物的引物的碱基组成应平衡碱基组成应平衡,避免出现,避免出现嘌呤、嘌呤、嘧啶碱基堆积嘧啶碱基堆积。C CG G的比例一般为的比例一般为45554555%。现在位置现在位置 P171第29页,讲稿共98张,创作于星期二目目 录录5.5.PCRPCR扩增中的退火温度是根据引物的扩增中的退火温度是根据引物的TmTm值而决定的,值而决定的,二条引物的二条引物的TmTm值不能差别值不能差别
16、太大太大。6.6.根据需要,合成引物时根据需要,合成引物时在其在其55端可以端可以加修饰成分加修饰成分如加入如加入酶切位点酶切位点,用,用生物素、荧光素、地生物素、荧光素、地高辛等标记高辛等标记,引入,引入突变位点突变位点,引入,引入启动子启动子序列序列,引入,引入蛋白质结合蛋白质结合DNADNA序列序列等。等。现在位置现在位置 P171引物设计时必须遵循的原则引物设计时必须遵循的原则第30页,讲稿共98张,创作于星期二目目 录录三、三、反应条件反应条件1、温度、温度变性温度:一般把变性温度定在变性温度:一般把变性温度定在95959797之之间,以使模板间,以使模板DNADNA和产物和产物双链
17、完全打开双链完全打开。退火温度:退火温度决定退火温度:退火温度决定PCRPCR反应的特异性,反应的特异性,退火温度的设定取决于引物的退火温度的设定取决于引物的TmTm,通常,通常PCRPCR的的退火温度应退火温度应低于引物低于引物TmTm55左右。左右。延伸温度:一般为延伸温度:一般为7272,在这个温度下,在这个温度下TaqDNATaqDNA聚合酶具有较高的酶促活性聚合酶具有较高的酶促活性,有利于,有利于DNADNA的复制。的复制。现在位置现在位置 P172第31页,讲稿共98张,创作于星期二目目 录录2、时间、时间 nPCRPCR循环中每个步骤所需的循环中每个步骤所需的时间时间取决于取决于
18、所扩增片段的长度所扩增片段的长度。n以长度为以长度为2002001000bp1000bp的扩增片段为例,循环中变性、退火和的扩增片段为例,循环中变性、退火和延伸三个步骤的持续时间延伸三个步骤的持续时间一般均为一般均为3030秒秒1 1分钟分钟。n在模板(尤其是基因组在模板(尤其是基因组DNADNA)进行)进行第第1 1次变性时应给予足够长次变性时应给予足够长的时间的时间(5 57 7分钟,根据变性温度高低而异)以使模板彻底变分钟,根据变性温度高低而异)以使模板彻底变性,然后再进入循环。性,然后再进入循环。n时间时间过长过长会会降低扩增的特异性降低扩增的特异性。现在位置现在位置 P173第32页
19、,讲稿共98张,创作于星期二目目 录录3、循环次数、循环次数 n循环次数一般为循环次数一般为20204545次。次。nPCRPCR扩增效率呈扩增效率呈S S型曲线,有平台效应型曲线,有平台效应n平台效应的原因:平台效应的原因:初始模板量初始模板量引物二聚体和反应产物抑制扩增引物二聚体和反应产物抑制扩增反应体系的组份被消耗反应体系的组份被消耗引物与模板引物与模板DNADNA间竞争间竞争 现在位置现在位置 173第33页,讲稿共98张,创作于星期二目目 录录四、四、PCRPCR技术的质量控制技术的质量控制n硬件方面硬件方面实验室规范化设置实验室规范化设置n软件方面软件方面n样本采集样本采集n核酸提
20、取核酸提取n扩增扩增n产物分析产物分析n测定结果的报送测定结果的报送现在位置现在位置 P173第34页,讲稿共98张,创作于星期二目目 录录(一)实验室的规范化设置(一)实验室的规范化设置n 临床基因扩增检验实验室必须包括临床基因扩增检验实验室必须包括四个工作区域四个工作区域:试剂贮存和准备区试剂贮存和准备区;标本制备区标本制备区;扩增反应区扩增反应区;产物分析区产物分析区。n这四个区域必须这四个区域必须互相独立互相独立,并严格,并严格按照上述顺序设置按照上述顺序设置。n每一区域都必须每一区域都必须配置专用仪器配置专用仪器,所用物品、试剂和耗材不得从某一个,所用物品、试剂和耗材不得从某一个区域
21、移至另一个区域使用。区域移至另一个区域使用。现在位置现在位置 P174第35页,讲稿共98张,创作于星期二目目 录录(二)(二)PCR技术的质量保证技术的质量保证 PCR PCR技术用于临床检验的质量保证主要技术用于临床检验的质量保证主要涉及涉及基因扩增检验全过程基因扩增检验全过程的质量保证、的质量保证、室内质量控制室内质量控制和和室间质量评价室间质量评价。现在位置现在位置 P129第36页,讲稿共98张,创作于星期二目目 录录(二)(二)PCR技术的质量保证技术的质量保证n样本采集样本采集n核酸提取核酸提取n扩增扩增n产物分析产物分析n测定结果的报送测定结果的报送现在位置现在位置 P129第
22、37页,讲稿共98张,创作于星期二目目 录录(一)目的基因的克隆(一)目的基因的克隆(二)基因的体外突变(二)基因的体外突变(三)(三)DNA和和RNA的微量分析的微量分析(四)(四)DNA序列测定序列测定(五)基因突变分析(五)基因突变分析四、四、PCR的主要用途的主要用途现在位置现在位置 P第38页,讲稿共98张,创作于星期二目目 录录第二节以以PCR为基础的相关技术为基础的相关技术第39页,讲稿共98张,创作于星期二目目 录录(一)逆转录PCR技术(二)巢式(三)定量PCR技术()(四)多重PCR技术(五)PCR诱导定点突变(六)原位PCR技术(七)差异显示PCR技术(X)免疫PCR技术
23、现在位置现在位置 P174以以PCR为基础的相关技术为基础的相关技术第40页,讲稿共98张,创作于星期二目目 录录(一)、逆转(一)、逆转录录PCRPCRn逆转录逆转录PCRPCR(reverse transcription PCR,reverse transcription PCR,RT-PCRRT-PCR)是以细胞内)是以细胞内总总RNARNA或或mRNAmRNA为材料进行体外扩增的技术。为材料进行体外扩增的技术。n由于耐热的由于耐热的DNADNA聚合酶不能以聚合酶不能以RNARNA或或mRNAmRNA作为模板,因此作为模板,因此首先必首先必须将总须将总RNARNA或或mRNAmRNA作逆
24、转录,以生成与之互补的作逆转录,以生成与之互补的cDNAcDNA,然后,然后再再以以cDNAcDNA作为模板进行作为模板进行PCRPCR扩增扩增,得到所需的目的基因片段。,得到所需的目的基因片段。nRT-PCRRT-PCR主要用于主要用于克隆克隆cDNAcDNA、合成合成cDNAcDNA探针探针、检测检测RNARNA病毒和分病毒和分析基因表达析基因表达等。等。现在位置现在位置 174第41页,讲稿共98张,创作于星期二目目 录录(二)、巢式(二)、巢式PCRPCRn巢式巢式PCRPCR(nested PCRnested PCR)是对靶基因进行)是对靶基因进行二次扩增二次扩增。n二次扩增所用的引
25、物不能相同,第二次扩增所用的引二次扩增所用的引物不能相同,第二次扩增所用的引物必须位于第一次扩增所用引物的物必须位于第一次扩增所用引物的内侧内侧n先用第一对引物扩增出一个较大的片段,再用第二先用第一对引物扩增出一个较大的片段,再用第二对引物进行第二次扩增对引物进行第二次扩增n第二次扩增的模板是第一次扩增的产物第二次扩增的模板是第一次扩增的产物现在位置现在位置 174第42页,讲稿共98张,创作于星期二目目 录录(二)、巢式(二)、巢式PCRPCR现在位置现在位置 174引物1引物2nest要扩增的目标基因第43页,讲稿共98张,创作于星期二目目 录录(三)、定量(三)、定量PCRPCRn相对定
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