动物细胞工程第四节 培养细胞的观察 检测方法课件 高中生物竞赛.ppt
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1、第四节培养细胞的观察检测方法,活细胞的观察检测方法 培养细胞常用的染色方法 细胞生长状况有关指标的检测方法 细胞生物活性的有关化学检测方法 电子显微镜技术 流式细胞术,一、活细胞的观察检测方法,肉眼观察 相差显微镜观察,细胞在体外培养过程中需要每天观察,以便及时了解细胞生长状态、数量改变、细胞形态、细胞有无移动、有无污染、培养液pH是否变酸、变黄、是否更换等。 细胞常规检查的方法为:,肉眼观察,一般常规检查用肉眼即可观察,主要看培养液的颜色和透明度的变化。 pH 颜色 透明度 正常 7.27.4 桃红色 清亮、透明 酸性产物 变浅、变黄 污染 混浊,变黄 pH 变红 pH ,显微镜观察,相差显
2、微镜 (phase contrast microscope) 20世纪30年代 荷兰 Zernike 原理:利用光的衍射和干涉特性,把透过标本不同区域的光波的光程差转变成振幅差,使细胞内各种结构之间呈现清晰可见的明暗对比,从而使标本的各种结构变得清晰。,相差显微镜观察活细胞,Anip973,注意事项,标准化生产的培养板、培养瓶或皿一般成像效果都较好,但反复刷洗过的玻璃或塑料器皿将严重影响分辨力。 准备观察的瓶、皿要平坦,质地均匀,透光度好,在观察前将培养瓶、皿面擦净。 天气较冷时,由于温差使培养瓶内壁形成雾滴而影响观察的清晰度,可轻轻将瓶倾斜使瓶内培养液浸润内壁,以得到好的相差像。 对原代细胞
3、培养进行相差显微照相,应在换液后进行,这样可以去除漂浮的组织块和死细胞,提高成像清晰度。 观察细胞时要有无菌概念,动作要轻,避免猛烈震荡;观察时间不要太长,观察次数也不要太频繁,以免影响细胞生长。,显微镜观察,二、培养细胞常用的染色方法,细胞固定的基本方法 细胞常用的染色方法 细胞特殊的染色方法,体外细胞染色观察,体外活细胞染色就是在体外培养条件下,用某种染料对活细胞进行染色。利用这种方法,可以对培养物进行染色观察,经一些染料染色的培养物还可以继续进行培养。,碱性染料 酸性染料(台盼蓝、刚果红、吡咯蓝),活体染料,噻嗪类(亚甲基蓝、甲苯胺蓝) 恶嗪类(亮焦油蓝、亮焦油紫(尼氏体) 丫嗪类(中性
4、红、詹纳斯绿) 三酚苯甲烷类(甲基紫、维克多利亚蓝),詹姆斯绿,结晶紫染色,台盼蓝染色,亚甲基蓝,细胞核,线粒体,死细胞染色、 也可染巨噬细胞,中性红染色 常用活体染料,一般浓度为1:10000,用生理盐水(或Hanks液)溶解后进行高压蒸汽灭菌暗处存放,可直接浸染活体细胞显微镜下观察或用于细胞的病毒蚀斑。因其毒性大,染色后细胞不能再培养。 结晶紫染色 使用浓度为0.1,可用生理盐水配制,室温保存。该染料对死、活细胞均着色,故只能测出细胞总数。 台盼蓝染色 用0.4浓度的台盼蓝(trypan blue),用PBS配制,室温保存,该染料只对死细胞着色,可测定活细胞数和计算存活百分率。,1、细胞固
5、定的基本方法,固定组织、细胞的目的: 把细胞的原有结构尽可能完整地保存下来,避免细胞发生降解、自溶、腐败和变形等;同时,固定还可以使细胞的各部分易于着色,适于观察、长期保存和分析。 固定组织、细胞的原则: 尽可能选用新鲜培养物;根据检测工具、对象、目的和要求选择固定剂和固定方法。,固定前的准备: 各种细胞培养物,如双盖片悬滴培养物、悬液培养物、单层培养物和盖片单层培养物都可作固定材料。 悬浮细胞:离心(8001000r/min)PBS/Hanks漂洗23次 贴壁细胞: 用镊子轻轻取出盖片PBS/Hanks漂洗23次 注:漂洗的目的是去除血清和附着于细胞表面的残渣,防止其妨碍染色。,常用固定液,
6、简单固定液:甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、戊二醛、苦味酸、重铬酸钾、锇酸等 混合固定液:甲醇/醋酸固定液、FAA固定液、Carnoy固定液、Bouin固定液、4多聚甲醛-PBS固定液等 甲醇/醋酸固定液:甲醇:冰醋酸为3:1,现用现配,适用于Giemsa染色。 FAA固定液:90mL 80酒精5mL 冰乙酸5mL 40甲醛,适用于盖片单层培养的细胞,固定效果好。 Carnoy固定液:较好的非水溶性固定液,60mL 纯酒精30mL 氯仿10mL 冰乙酸,适用于显示细胞化学成分。,2、细胞常用的染色方法,H.E(苏木精-伊红)染色法 原理:碱性染料苏木精和酸性染料伊红分别与细胞核和细胞质发生反应,使细胞
7、微细结构通过颜色而改变它的折射率,从而在光镜下能清晰地呈现出细胞图像,并能提供良好的核浆对比染色。 染色结果:细胞核染成蓝色,细胞质染成红色。,Giemsa(吉姆萨)染色法,染色结果:细胞核染成红色,细胞质染成蓝色。,3、细胞特殊的染色方法,Feulgen染色法 Coomassie染色法 PAS反应法 油红O(oil red O)法 免疫荧光染色法 免疫酶染色法,Feulgen(福尔根)染色法,在60条件下,DNA分子中的嘌呤碱和脱氧核糖的连键可被1mol/L 盐酸水解打开,游离出的脱氧核糖醛基能与希夫(Schiff)试剂结合,形成紫红色复合物。在此过程中,RNA不受影响,故染色具DNA特异性
8、。准确的温度和盐酸浓度,适宜的水温、时间是成功的关键。水温过度或不足均降低染色强度。此法能对DNA 进行特异性染色。,考马斯亮蓝(Coomassie,BB)染色法,原理:显示细胞骨架、胞内微丝染色方法 染色结构:细胞内的微丝呈现蓝色。,过碘酸席夫反应法(periodic acid Schiff reaction,PAS),细胞内糖类的染色方法 原理:过碘酸是一种强氧化剂,能将葡萄糖的乙二醇基(CHOH-CHOH)氧化成两个游离的醛基,它们与Schiff试剂反应生成紫红色产物。 染色结果:细胞含糖原区呈紫红色。,细胞内脂类的染色方法,苏丹(Sudan)/法 苏丹黑法 Lillie油红O(oil
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