第八章液相色谱精选文档.ppt
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1、第八章液相色谱本讲稿第一页,共五十五页第一节第一节 高效液相色谱法简介高效液相色谱法简介第二节第二节 高效液相色高效液相色谱谱的的类类型型 第三节第三节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪第四节第四节 高效液相色谱固定相高效液相色谱固定相第五节第五节 液相色谱流动相液相色谱流动相 第六节第六节 高效液相色谱检测器高效液相色谱检测器 第八章 高效液相色谱法本讲稿第二页,共五十五页第一节第一节高效液相色谱法简介高效液相色谱法简介本讲稿第三页,共五十五页 高高效效液液相相色色谱谱法法是是19641965年年开开始始发发展展起来的一项新颖快速的分离分析技术。起来的一项新颖快速的分离分析技术。它它是是在在经经
2、典典液液相相色色谱谱法法的的基基础础上上,引引入入了了气气相相色色谱谱的的理理论论,在在技技术术上上采采用用了了高高压压泵泵、高高效效固固定定相相和和高高灵灵敏敏度度检检测测器器后后,发发展展成成为为高高分分离离速速度度、高高分分离离效效率率、高高检检测测灵灵敏敏度度的的高效液相色谱法。也称现代液相色谱法。高效液相色谱法。也称现代液相色谱法。概述:概述:本讲稿第四页,共五十五页 共同点:共同点:高高效效液液相相色色谱谱是是在在气气相相色色谱谱高高速速发发展展的的情情况况下下发发展展起起来来的的,它它们们之之间间在在理理论论上上和和技技术术上上有有许许多多共共同同点。点。(1)色谱的基本理论是一
3、致的;)色谱的基本理论是一致的;(2)定性定量原理完全一样;)定性定量原理完全一样;(3)均均可可应应用用计计算算机机控控制制色色谱谱操操作作条条件件和和色色谱谱数数据的处理程序,自动化程度高。据的处理程序,自动化程度高。液相色谱和气相色谱的异同点:液相色谱和气相色谱的异同点:本讲稿第五页,共五十五页1.流动相差别流动相差别2.固定相差别固定相差别3.使用范围更广使用范围更广4.4.在原理和结构方面有差异在原理和结构方面有差异 因因液液相相色色谱谱的的流流动动相相是是液液体体,其其粘粘度度比比气气体体大大100100倍倍以以上上,扩扩散散系系数数比比气气体体小小10102 210105 5倍倍
4、;因因此此溶溶质质分分子子与与液液体体流流动动相相之之间间的的作作用用力力不不能能忽忽略略,致致使使液液相相色谱与气相色谱有以下的差别:色谱与气相色谱有以下的差别:二者的差异:二者的差异:液相与气相差异液相与气相差异本讲稿第六页,共五十五页流动相:气相色谱为气体、液相色谱为液体。流动相:气相色谱为气体、液相色谱为液体。以以液液体体作作流流动动相相,液液体体分分子子与与样样品品分分子子间间的的作作用用力力不不能能忽忽略略;液液体体种种类类多多,性性质质差差别别大大,水水溶溶液液或或有有机机溶溶剂剂,极极性性或或非非极极性性化化合合物物,可可供供选选择择的的范范围围广广。是是控控制制柱柱效效和和分
5、分离离效效率率的的重重要因素之一。要因素之一。使使高高效效液液相相色色谱谱除除了了固固定定相相的的选选择择外外,增增加了一个可供选择的重要的操作参数。加了一个可供选择的重要的操作参数。液相与气相差异液相与气相差异1.1.流动相差别流动相差别本讲稿第七页,共五十五页 气气相相色色谱谱固固定定相相多多为为固固体体吸吸附附剂剂或或在在担担体体表表面面上上涂涂渍渍一一层层高高沸沸点点有有机机液液体体而而成成的的液液体体固固定定相相、近近年年才才出出现现一一些些化化学学键键合合相相,粒粒度度粗粗(100(100250250m)m),吸附等温线多是非线性的,成本较低。,吸附等温线多是非线性的,成本较低。高
6、高效效液液相相色色谱谱固固定定相相大大都都是是新新型型的的固固体体吸吸附附剂剂或或化化学学键键合合相相,粒粒度度小小(3(31010m)m),分分配配等等温温线线多多是是线线性性的的,峰峰形形对对称称,成成本本较较高高,发发现现容容量量大,分析型色谱柱最大容量可达大,分析型色谱柱最大容量可达50mg50mg以上。以上。液相与气相差异液相与气相差异2.2.固定相差别固定相差别本讲稿第八页,共五十五页 气气相相色色谱谱分分析析是是沸沸点点在在500500以以下下、分分子子量量少少于于450450的的物物质质。对对热热稳稳定定性性差差、易易于于分分解解变变质质,或或具具有有生生理理活活性性的的物物质
7、质,都都不不能能用用升升温温气气化化的的方方法法分分析析。气气相相色色谱谱只只能能分分析析约约占占有有机机物物总总数数15%15%20%20%的物质。的物质。高高效效液液相相色色谱谱在在室室温温或或接接近近室室温温条条件件下下工工作作,可可分分析析沸沸点点在在500500以以上上、分分子子量量450450以以上上的的有有机机物物质质,约约占占总总数数的的80%80%85%85%。高高效效液液相相色色谱谱的的使使用用范范围围远远远远超超过气相色谱。过气相色谱。液相与气相差异液相与气相差异3.使用范围广本讲稿第九页,共五十五页 高压液相色谱仪具有高压输液泵和输液高压液相色谱仪具有高压输液泵和输液系
8、统,其检测器的检测原理和结构与气相系统,其检测器的检测原理和结构与气相色谱也有较大差异。色谱也有较大差异。高效液相色谱和气相色谱在功能方面高效液相色谱和气相色谱在功能方面各有所长、相互补充。各有所长、相互补充。在高效液相色谱广泛应用的同时,气在高效液相色谱广泛应用的同时,气相色谱仍然发挥着它的重要作用。相色谱仍然发挥着它的重要作用。液相与气相差异液相与气相差异4.在原理和结构方面的不同本讲稿第十页,共五十五页一、液液色谱法,一、液液色谱法,二、液固色谱法,二、液固色谱法,三、离子交换色谱法三、离子交换色谱法四、排阻色谱。四、排阻色谱。第二节第二节 高效液相色谱的类型高效液相色谱的类型本讲稿第十
9、一页,共五十五页一、液液色谱法一、液液色谱法 涂涂渍渍固固定定相相,将将某某些些固固定定液液涂涂渍渍在在惰惰性性担担体体的的表表面面;涂涂渍渍的的固固定定相相,固固定定液液易易于于流流失失,柱柱子子寿寿命命短短,分分离离的的重重现现性性和和分分离离效效果果好好,是是目目前前固固定相的发展方向。定相的发展方向。化化学学键键合合固固定定相相,把把化化学学基基团团与与惰惰性性担担体体反反应应,使使其其以以共共价价键键的的形形式式结结合合在在担担体体表表面面上上。柱子性质稳定、寿命长。柱子性质稳定、寿命长。又称液液分配色谱。又称液液分配色谱。1 1、液液色谱固定相的形式,两种:、液液色谱固定相的形式,
10、两种:本讲稿第十二页,共五十五页 不不同同溶溶质质在在两两个个液液相相中中,有有不不同同的的分分配配系系数数。化化学学键键合合相相的的液液液液色色谱谱,分分配配机机理理和和吸吸附附机机理理同同时时存存在在。为为了了防防止止色色谱谱分分离离过过程程中中两两相相的的混混溶溶,流流动动相相与与固固定定相相的极性必须不同。的极性必须不同。2 2、分离原理、分离原理 当当固固定定相相为为极极性性时时,流流动动相相为为非非极极性性溶溶剂剂,此此时时组组分分流流出出先先后后的的顺顺序序是是非非极极性性向向极极性性过过度度,称称为为正正相相色色谱。谱。固固定定相相为为非非极极性性,用用极极性性溶溶剂剂作作流流
11、动动相相,组组分分的的流流出出顺顺序是极性组分先流出,称为序是极性组分先流出,称为反相色谱反相色谱。3 3、正相色谱和反相色谱、正相色谱和反相色谱本讲稿第十三页,共五十五页 固固定定相相与与正正相相色色谱谱或或反反相相色色谱谱相相同同,流流动动相相是是含含有有适适当当有有机机反反离离子子的的溶溶剂剂,它它能能与与组组分分生生成成离离子子对对,称称为为正正相相离离子子对对色色谱谱或或反反相相离离子子对对色色谱谱。离离子子对对色色谱谱,可以分析离子型或可离解的化合物。可以分析离子型或可离解的化合物。4、液液色谱的一种特殊形式液液色谱的一种特殊形式 离子对色谱离子对色谱本讲稿第十四页,共五十五页二、
12、液固色谱二、液固色谱也称液固吸附色谱液固吸附色谱 1、固定相:、固定相:以固体吸附剂如硅胶,各种微球硅珠,以固体吸附剂如硅胶,各种微球硅珠,氧化镁,氧化铝,活性炭,聚酰胺等作为固定相。吸附剂氧化镁,氧化铝,活性炭,聚酰胺等作为固定相。吸附剂粒度约粒度约20205050m m或或35357575m m左右,比液液色谱固定左右,比液液色谱固定相相(3(31010m)m)的粒度大。的粒度大。2、分离原理:、分离原理:吸附剂表面与溶质分子中功能团的吸吸附剂表面与溶质分子中功能团的吸附与解吸作用,是溶质分子与溶剂分子对固定相的竞争吸附与解吸作用,是溶质分子与溶剂分子对固定相的竞争吸附的能力差异。附的能力
13、差异。溶剂的极性强弱对分离和分析速度影响很大,液溶剂的极性强弱对分离和分析速度影响很大,液固色谱主要用来分析具有极性官能团、且极性不太固色谱主要用来分析具有极性官能团、且极性不太强的化合物。强的化合物。本讲稿第十五页,共五十五页 吸吸附附剂剂对对同同系系物物的的选选择择分分离离能能力力小小,对对不不同同族族化化合合物物的选择分离能力强。主要用于按族分离化合物。的选择分离能力强。主要用于按族分离化合物。溶溶质质分分子子在在吸吸附附剂剂活活性性中中心心上上的的吸吸附附能能力力与与分分子子的的几几何何形形状状有有关关,液液固固色色谱谱对对异异构构体体有有高高的的选选择择性性,能能分分离离几几何何异异
14、构构体体(顺顺反反异异构构体体)和和同同分分异异构构体体(不同取代位不同取代位)。缺缺点点:重重复复性性差差。对对流流动动相相的的含含水水量量须须严严格格控控制制,方方能能获获得得有有重重复复性性的的保保留留值值。每每次次分分析析后后,特特别别是是作作梯梯度度洗洗脱时,色谱柱再生的时间很长,耗费溶剂多。脱时,色谱柱再生的时间很长,耗费溶剂多。3 3、液固色谱分离特点、液固色谱分离特点本讲稿第十六页,共五十五页三、离子交换色谱三、离子交换色谱 1 1、固定相:、固定相:为带有电荷官能团的离子交换剂,并为带有电荷官能团的离子交换剂,并存在带相同电荷数的相反离子存在带相同电荷数的相反离子反离子。根据
15、分离反离子。根据分离离子的不同而采用阳离子交换剂离子的不同而采用阳离子交换剂(-SO(-SO3 3-等基团等基团)或阴或阴离子交换剂离子交换剂(-N(CH(-N(CH3 3)3 3+等等)。2 2、机机理理:流流动动相相中中被被分分析析的的离离子子与与反反离离子子之之间间发发生生竞竞争吸附。根据吸附能力不同将物质分离。争吸附。根据吸附能力不同将物质分离。离子交换色谱主要用于分离能解离为离子的化合离子交换色谱主要用于分离能解离为离子的化合物,如无机离子、核酸、氨基酸等。物,如无机离子、核酸、氨基酸等。本讲稿第十七页,共五十五页交换剂交换剂R+Y-交换剂交换剂R+Y-X-X-交换吸附交换吸附 交交
16、换换剂剂R R+的的反反离离子子Y Y-是是阴阴离离子子的的为为阴阴离离子子交交换换色色谱谱。交交换换剂剂R R-带带负负电电荷荷,其其反反离离子子Y Y+为阳离子的称为阳离子交换色谱。为阳离子的称为阳离子交换色谱。离子交换色谱的吸附示意离子交换色谱的吸附示意本讲稿第十八页,共五十五页四、凝胶色谱四、凝胶色谱 也称排阻色谱、空间排阻色谱等。凝胶色谱是也称排阻色谱、空间排阻色谱等。凝胶色谱是基于分子大小不同而进行分离的一种色谱技术。基于分子大小不同而进行分离的一种色谱技术。1 1、固固定定相相:凝凝胶胶。是是一一种种表表面面惰惰性性,含含有有许许多多不不同同尺尺寸寸孔孔穴穴或或立立体体网网状状结
17、结构构的的物物质质。凝凝胶胶的的孔孔穴穴大大小小应应与与被被分分离离组组分分的的大大小小基基本本相当。相当。本讲稿第十九页,共五十五页2 2、分分离离原原理理:当当试试样样随随流流动动相相在在凝凝胶胶外外的的间间隙隙和和凝凝胶胶空空穴穴中中流流动动时时,分分子子体体积积大大的的不不能能渗渗透透到到凝凝胶胶孔孔穴穴中中去去,随随流流动动相相快快速速流流出出。中中等等大大小小的的分分子子,能能选选择择性性地地渗渗透透到到部部分分孔孔穴穴中中去去,流流出出稍稍慢慢。分分子子体体积积小小的的,则则渗渗透透到到凝凝胶胶内内部部的的孔孔穴穴深深处处中中,移出困难,被冲洗出来的速度慢。移出困难,被冲洗出来的
18、速度慢。分分子子越越小小,在在孔孔穴穴的的渗渗透透越越深深,流流出出越越慢慢。这这样样,各各组分按分子大小先后从柱中流出。组分按分子大小先后从柱中流出。本讲稿第二十页,共五十五页 3 3、应用:、应用:凝胶色谱主要是分离和鉴定高分子凝胶色谱主要是分离和鉴定高分子量的化合物。对于分子量高达量的化合物。对于分子量高达150000000150000000的特大分的特大分子的混合物也可进行分离和鉴定。子的混合物也可进行分离和鉴定。凝胶颗粒的微孔直径大小可根据分析的要求加以凝胶颗粒的微孔直径大小可根据分析的要求加以选择。其孔径的线性范围不同,可以用于分离不同分选择。其孔径的线性范围不同,可以用于分离不同
19、分子量范围的组分。子量范围的组分。凝胶色谱在生物样品凝胶色谱在生物样品(蛋白质、酶、核酸等蛋白质、酶、核酸等)与高分子与高分子化合物的化学分析中有重要的应用价值。化合物的化学分析中有重要的应用价值。本讲稿第二十一页,共五十五页第三节第三节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪 现现代高效液相色代高效液相色谱仪谱仪,在复,在复杂杂程度及各程度及各种部件的功能上都有很大的差种部件的功能上都有很大的差别别。仪器的基仪器的基本结构可分为:本结构可分为:液相输送系统,进样系统,色液相输送系统,进样系统,色谱分离系统与检测记录数据处理系统谱分离系统与检测记录数据处理系统等四部分。等四部分。本讲稿第二十二页,共五十
20、五页液相色谱仪的结构示意图液相色谱仪的结构示意图馏分馏分收集器收集器高压高压输液泵输液泵贮液器贮液器梯度洗脱装置梯度洗脱装置液液相相输输送送系系统统进进样样阀阀进样系统进样系统色色谱谱柱柱色色谱谱分分离离系系统统检测记检测记 录系统录系统 检测器检测器记录仪记录仪本讲稿第二十三页,共五十五页一、液相输送系统一、液相输送系统 液相输送系统包括:液相输送系统包括:贮液槽、高压泵贮液槽、高压泵,有的,有的还配备有还配备有梯度洗脱装置梯度洗脱装置。1 1、贮液槽:、贮液槽:贮存流动相,容量为贮存流动相,容量为0 0.5 51L1L。流流动动相相必必须须脱脱气气,除除去去溶溶解解在在流流动动相相中中的的
21、空空气气,以以防防止止溶溶解解的的空空气气在在检检测测池池内内形形成成气气泡泡,引引起起基基线线漂漂移,或不规则的噪音。移,或不规则的噪音。脱脱气气的的方方法法:(1)(1)超超声声波波振振动动脱脱气气,(2)(2)加加热热沸沸腾回流脱气腾回流脱气 (3)(3)真空脱气。真空脱气。本讲稿第二十四页,共五十五页 高高压压输输液液泵泵的的作作用用是是输输送送恒恒定定流流量量的的流流动动相相。按输液特性可分为:恒流泵和恒压泵。按输液特性可分为:恒流泵和恒压泵。(1)(1)恒恒流流泵泵 主主要要优优点点是是始始终终输输送送恒恒定定流流量量的的液液体体,与与柱柱压压力力的的大大小小和和压压力力的的变变化
22、化无无关关。因因此此,保保留留值值的的重重复复性性好好,基基线线稳稳定定,能能满满足足高高精精度度分分析和梯度洗脱的要求。析和梯度洗脱的要求。2.2.高压输液泵高压输液泵本讲稿第二十五页,共五十五页 恒流泵的主要类型为:恒流泵的主要类型为:柱塞式柱塞式往复泵。往复泵。该该泵泵的的主主要要优优点点:输输液液连连续续,流流速速与与色色谱谱系系统统的的压压力力无无关关,泵泵室室的的体体积积很很小小(几几微微升升到到几几十十微微升升)。适适用用于于梯梯度度洗洗脱脱和和再再循循环环洗洗脱脱,清清洗洗方方便便,更更换换溶剂容易。溶剂容易。缺缺点点:输输送送有有脉脉动动的的液液流流,液液流流不不稳稳定定,引
23、引起起基基线线噪噪声声。克克服服的的方方法法是是在在泵泵和和色色谱谱柱柱间间串串入一根盘状阻尼管,使液流平稳。入一根盘状阻尼管,使液流平稳。本讲稿第二十六页,共五十五页 恒恒压压泵泵通通过过采采用用适适当当的的气气动动装装置置,使使高高压压惰惰性性气气体体直直接接加加压压于于流流动动相相,输输出出无无脉脉动动的的液液流流。也也称称为为气气动动泵泵。这这种种泵泵简简单单价价廉廉,但但流流速速不不如如恒恒流流泵泵精精确确稳稳定定。只只适适用用于于对流速精度要求不高的分析或作为装填色谱柱用泵。对流速精度要求不高的分析或作为装填色谱柱用泵。恒恒压压泵泵的的优优点点:容容易易获获得得高高压压,没没有有脉
24、脉冲冲,流流速速范围大。范围大。缺缺点点:受受系系统统压压力力变变化化的的影影响响大大,保保留留值值重重复复性性较较差差,不不适适于于梯梯度度洗洗脱脱操操作作。泵泵体体积积较较大大,更更换换溶溶剂剂麻麻烦烦、耗费量大耗费量大。(2 2)恒压泵)恒压泵本讲稿第二十七页,共五十五页 洗脱装置有两种工作方式:洗脱装置有两种工作方式:一一种种是是以以两两台台或或多多台台高高压压泵泵将将不不同同的的溶溶剂剂吸吸入入混混合合室室,在在高高压压下下混混合合,然然后后进进入入色色谱谱柱柱。优优点点是是通通过过电电子子器器件件分分别别程程序序控控制制两两台台或或多多台台输输液液泵泵的的流流量量,就就可可以以获获
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