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1、精选学习资料 - - - - - - - - - 无菌检查操作规程1. 目的建立无菌检查标准操作规程,确保检查结果精确、牢靠;2. 使用范畴本公司无菌产品的无菌检查3. 职责质量部 QC 4.依据1101 2022 版中国药典通就GB/T 19973.2-2005ISO11737-2:1998疗器械的灭菌微生物学方法第 2 部分:确认灭菌过程的无菌试验5.医用输液、输血、注射器具检验方法 第 2 部分:生物学试验方法内容5.1. 无菌检查环境保证5.1.1. 无菌检査的全部操作均需在严格掌握微生物污染的环境下进行,即无菌检査应在环境干净度 10000级下的局部干净度 100级的单向流空气区域内
2、或隔离系统中进行;5.1.2. 操作环境的无菌保证程度将直接影响无菌检查结果,为了保证无菌检查用干净室区环境的稳固性,确保检查结果的牢靠性,对干净室区的环境定期监测并实行合理的措施保证干净环境符合要求;5.1.3. 无菌检查全过程必需严格遵守无菌操作,防止微生物污染;5.1.4. 干净区的温度、湿度等参数必需符合相应干净级别的要求;5.1.5. 无菌检查操作仍需要对检查环境进行监控,5.2. 培育基、稀释液、缓冲液5.2.1. 硫乙醇酸盐流体培育基,市售培育基干粉;除另有规定,接种后应置 3035培育;5.2.2. 胰酪大豆胨液体培育基,市售培育基干粉;接种后应置 2035培育;5.2.3.
3、中和或灭活用培育基, 按上述硫乙醇酸盐流体培育基或胰酪大豆胨液体培名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页,共 11 页精选学习资料 - - - - - - - - - 养基的处方及制法, 在培育基灭菌或使用前加入相宜的中和剂、灭活剂或 外表活性剂,其用量同方法适用性试验;5.2.4. 胰酪大豆胨琼脂培育基,市售培育基干粉;5.2.5. 沙氏葡萄糖液体培育基,市售培育基干粉;5.2.6. 沙式葡萄糖琼脂培育基,市售培育基干粉;5.2.7. 氯化钠蛋白胨缓冲液,市售培育基干粉;5.2.8. 0.9%无菌氯化钠溶液;5.2.9. 培育基使用性检查 无菌检査用的硫乙醇酸盐流体培育基和胰酪大
4、豆胨液体培育基等应符培养基的无菌性检査及灵敏度检査的要求;品的无菌检査同时进行;5.2.9.1. 无菌性检查:每批培育基随机取 培育 14 天,应无菌生长;5.2.9.2. 灵敏度检查本检查可在供试品的无菌检査或与供试5 支瓶,按各培育基规定的温度下5.2.9.2.1. 菌种:培育基灵敏度检查所用的菌株传代数不得超过 5 代 从菌种存中心获得的干菌种第0 代,并采纳相宜的菌种保藏技术进行储存,以证试验菌株的生物学特性;金黄色葡萄球菌 CMCCB26 003 铜绿假单胞菌 CMCCB10 104 枯草芽孢杆菌 CMCCB63 501 生孢梭菌 CMCCB64 941 白色念珠菌 CMCCF98
5、001 黑曲霉 CMCCF98 003 5.2.9.2.2. 菌液制备:接种金色葡萄球菌、铜绿假胞菌、枯草芽孢杆菌的培育物 至胰酪大豆胨液体培育基中或胰酪大豆胨琼脂培育基上,接种生孢梭菌的培育物至硫乙醇酸盐流体培育基中,30. 35培育 18. 24 小时;接种白色念珠菌的培育物至沙氏葡萄糖液体培育基中或沙氏葡萄糖琼 脂培育基上, 20. 25培育 24. 48 小时,上述培育后的新奇培育物用名师归纳总结 无菌化钠 - 蛋白胨缓冲液或0.9%无菌化钠溶液制成每lml 菌数小于第 2 页,共 11 页- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 100cfu 菌落形
6、成的菌悬液;接种黑曲霉的培育物至沙氏葡萄糖琼脂面培育基上, 20. 25培育 5. 7 天,加人 3. 5 ml 0.05%ml/ml 聚山梨酯 80 的无菌化钠 - 蛋白胨缓冲液或 0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱;然后,采纳相宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内,用 0.05% ml/ml聚山梨醋 80 的无菌化钠 - 蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成每lml 孢子数量小于 100cfu 的孢子悬液; 菌悬液假设在室温下放置, 应在2 小时内使用;假设储存在2. 8 在 24h 内使用;黑曲霉孢子悬液存在 2. 8,在验证过的贮存期内用;5.2.9.2.3. 培育基接种:取每管装量为
7、 12ml 的硫乙醇酸盐流体培育基 7 支,分别接种小于 100cfu 的色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌各 2 支,另1 支不接种作为空白对比, 培育 3 天;取每管装量为 9ml 的胰酪大豆胨液体培育基 7 支,分别接种小于100cfu 的草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各 2 支,另 1 支不接种作为空白对比,培育 5 天;逐日观看结;5.2.9.2.4. 结果判定:空白管应无菌生长,加菌的管生长良好,说明该培育基灵 敏度符合规定;5.3. 方法试用性试验 进行产品无菌检查时,应进行方法适用性试验,以确认所采纳的方法适 合于产品的无菌检查;假设检验程序或产品发生化可能影响检验结果时,应
8、重新进行方法适用性试验;方法适用性试验按“ 供试品的无菌检查” 的规定 及以下要求进行操作;对每一试验菌应逐一进行方法;5.3.1. 菌种及菌液的制备:大肠埃希菌CMCCB44 102 外,金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌株及菌液制同“ 培育 基灵敏度检查” ;大肠埃希菌的菌液制同金黄色葡萄球菌;5.3.2. 薄膜过滤法:每种培育基规定接种的供试品总量按薄膜过滤法过滤,冲洗,在最终一次的冲洗液中加入小于100cfu 试验菌,过滤;加硫乙醇酸盐流体培育基或胰酪大豆胨液体培育基至滤筒内;另取一装有同体积培育基的容器,加入等量试验菌,作为对比;置规定温度下培育,培育时间
9、不得超过 5 天,各试验菌同法作;名师归纳总结 5.3.3. 直接接种法:取符直接接种法培育基用量要求的硫乙醇酸盐流体培育基6第 3 页,共 11 页- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 管,分别接入小于100cfu 的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌各2 管,取符直接接种法培育基用量要求的胰酪大豆胨液体培育基 6 管,分别接入小于 100cfu 的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、 黑曲霉各 2 管;其中1 管接入每支培育基规定的供试品接种量,另 1 管作对比,置规定的温度培育,培育时间不得超过 5 天;5.3.4. 结果判定:与对比管比较, 如供试品各容器
10、中的试验菌均生长良好,就说明供试品的检验量在检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽视不计,照此检査方法和检查条件进行供试品的无菌检查;如供试品的任一容器中的试验菌生长柔弱、 缓慢或不生长, 就说明供试品的检验量在检验条件下 有抑菌作用, 应采纳增加冲洗量、 增加培育基的用量、 用中和剂或灭活剂、更换滤膜品种等方法, 排除供试品的抑菌作用, 并重新进行方法适用性试 验;方法适用性试验与供试品的无菌检查同时进行;5.4. 供试品无菌检查 无菌检査法括薄膜过滤法和直接接种法;只要供试品性质答应,应采纳 薄膜过滤法; 供试品无菌检查所采纳的检查方法和检验条件应与方法适用性 试验确认的方法相同;无菌试验
11、过程中,假设需用面活性剂、灭活剂、中和剂等试剂,应证明 其有效性,且对微生物无毒性;5.4.1. 检验数量:除另有规定外,按表 1 规定;5.4.2. 检验量:即接种量,除另有规定外,按表 2 规定;5.4.3. 阳性对比: 应依据供试品特性挑选阳性对比菌:无抑菌作用及抗革兰氏阳性菌为主的供试品, 以金色葡萄球菌为对比菌; 抗革兰氏阴性菌为主的供 试品,以大肠埃希菌为对比菌; 抗厌氧菌的供试品, 以生孢梭菌为对比菌;抗真菌的供试品,以白色珠菌为对比菌;阳性对比试验的菌液制同“ ” ,加菌量小于 100cfu,供试品用量同供试品无菌检查时每份培育基接种的样品量;阳性对比管培育72 小时内应生长良
12、好;5.4.4. 阴性对比:供试品无菌检查时, 应取相应溶剂和稀释液、 冲洗液同法操作,作为阴性对比;阴性对比不得有菌生长;名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页,共 11 页精选学习资料 - - - - - - - - - 5.4.5. 供试品的处理及接种培育基操作时,用相宜的消毒液对供试品容器面进行彻消毒,如供试品容器内有肯定的真空度,可用相宜的无菌器材 如带有除菌过滤的针头向容器内导入无菌空气,再按无菌操作启开容器取出内物;5.4.5.1. 薄膜过滤法:薄膜过滤法一般应采纳封闭式薄膜过滤;无菌检査用的滤 膜孔径应不大于 0.45um,直径约 50mm;依据供试品及其溶剂的特性
13、选 择滤膜材质;使用时,应保证滤膜在过滤前后的完整性;5.4.5.1.1. 水溶性供试品:水溶性供试液过滤前应先将少量的冲洗液过滤,以润湿滤膜;取规定量,直接过滤,或混至含不少于100ml 相宜的稀释液的无菌容器中,混匀,立刻过滤;如供试品有抑菌作用,须用冲洗液冲洗滤膜,冲洗数一般不少于3 次每滤膜每次冲洗量一般为100ml,且冲洗量不得超过1000ml,以防止滤膜上的微生物受损耗,所用的冲洗量、冲洗方法同方法适用性试验中确定的;除生物制品外,一般 样品冲洗后, 1 份滤器中加人 100ml 硫乙醇酸盐流体培育基, 1 份滤器 中加入 100ml 胰酪大豆胨液体培育基;5.4.5.1.2. 非
14、水溶性供试品:取规定量,直接过滤;或混合溶于适量含聚山梨酯 80 或其他相宜乳化剂的稀释液中,充分混合,立刻过滤;用含 0.1%.1 %聚山梨酯 80 的冲洗液冲洗滤膜至少3 次;加入含或不含聚山梨酯80 的培育基;接种培育基照水溶液供试品项下的方法作;5.4.5.1.3. 具有导管的医疗器具输血、输液袋等供试品:取规定量,每个最 小装用 50. 100ml 冲洗液分别冲洗内壁,收集冲洗液于无菌容器中,然后照水溶液供试品项下方法作;同时应采纳直接接种法进行装中所 配带的针头、针管的无菌检査;5.4.5.2. 直接接种法:直接接种法适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检査的供试 品,即取规定量供试品分
15、别等量接种至硫乙醇酸盐流体培育基和胰酪大 豆胨液体培育基中;除生物制品外,一般样品无菌检查时两种培育基接 种的瓶或支数相同;除另有规定外,每个容器中培育基的用量不得大于接种到该容器中的供试品体积的10 倍,同时,硫乙醇酸流体培育基每管名师归纳总结 装量不少于15ml,胰大豆胨液体培育基每管装量不少于10ml;供试品第 5 页,共 11 页- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 检査时,培育基的用量和髙度同方法适用性试验中确定的;5.4.5.2.1. 灭菌医用器具供试品:取规定量,必要时应将其拆散或切成小碎段,等量接种于各管以浸没供试品的适量培育基中;5.4.
16、6. 培育及观看:将上述接种供试品后的培育基容器分别按各培育基规定的温度培育 14 天;培育期间应逐日观看并记录是有菌生长;如在加入供试品后或在培育过程中,培育基显现浑浊,培育14 天后,不能从外观上判定有无微生物生长,可取该培育液适量转种至同种新奇培育基中,培育 3 天,观看接种的同种新奇培育基是否再显现浑浊;或取培育液涂片,染色,镜检,判定是否有菌;5.4.7. 结果判定5.4.7.1. 阳性对比管应生长良好 就供试品符合规定;5.4.7.2. 阳性对比管应生长良好,阴性对比管无菌生长,供试品管都无菌生长,阴性对比管无菌生长, 供试品管中有任意一管有菌生长,就供试品不符合规定;5.4.7.
17、3. 阳性对比管应生长良好,阴性对比管无菌生长, 供试品管浑浊, 经确凿无菌生长, 就供试品符合规定; 经确证有菌生长, 就供试品不符合规定;5.4.7.4. 有以下情形的,判试验无效;5.4.7.4.1. 无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法 的要求;5.4.7.4.2. 回忆无菌试验过程,发觉有可能引起微生物污染的因素,并且已经确 证;5.4.7.4.3. 供试品管中生长的微生物经鉴定后,确证是因无菌试验中所用的物品 和或 无菌操作技术不当引起的;5.4.7.5. 试验假设经确认无效,就应重试;重试时,重新取同量供试品,依法检 查,假设无菌生长,判供试品符规定;假设
18、有菌生长,判供试品不符规 定;6. 相关文件干净区尘埃粒子监测操作规程干净区沉降菌监测操作规程名师归纳总结 - - - - - - -第 6 页,共 11 页精选学习资料 - - - - - - - - - 试验室干净区清洁、消毒操作规程干净区环境监测治理规程ZW 型集菌仪使用、保护操作规程SPX-150 型生化培育箱使用、保护操作规程MJK-150 型霉菌培育箱使用、保护操作规程SW-CJ系列干净工作台使用、保护规程阳性菌种治理规程7. 记录无菌检查原始记录名师归纳总结 - - - - - - -第 7 页,共 11 页精选学习资料 - - - - - - - - - 附表:表 1:批出厂产
19、品的最少检验数量供试品批产量接种每种培育基的最少检验数量医疗器具100 10%或 4 件取较多者100N500 10 件500 2%或 20 件取较少者注:表中最少检验数量不包括阳性对比用的供试品数量表 2:供试品的最少检验量供试品供试品装量每支供试品接入每种培育基的最少量医疗器具外科用敷料棉花及纱布取 100mg 或 13cm 缝合线、一次性医用材料整个材料注带导管的一次医疗器具二分之一内外表积其他医疗器具整个器具注切碎或拆散开注:假如医疗器械体积过大,培育基用量可再2000ml 以上,将其整个完全浸没;名师归纳总结 - - - - - - -第 8 页,共 11 页精选学习资料 - - -
20、 - - - - - - 无菌检查原始记录薄膜过滤法检验编号:产品名称年月日型号规格产品数量年月日产品批号灭菌批号灭菌有效期来源检品数量检验日期完成日期检验依据无菌检查标准操作规程检验结果培育基:硫乙醇酸盐流体培育基配制批号:胰酪大豆胨液体培育基配制批号:稀释液、冲洗液: 0.1%蛋白胨水溶液 PH7.0 氯化钠 -蛋白胨缓冲液 0.9%无菌氯化钠溶液 其他 配制批号:阳性对比菌菌液: 取对比菌新奇培育物,接种至适量的 0.9%无菌氯化钠溶液中,取 1ml进行 10 倍系列稀释,取稀释液作为对比菌液;对比菌名称:代数:计数结果:cfu/ml 仪器设备: ZW-808A 型集菌仪 仪器编号: M
21、JX-150 霉菌培育箱2025仪器编号: SPX-150 生化培育箱3035仪器编号:无菌集菌器: 批号:生产厂家:净化工作台环境监测 温度: 湿度:% 沉降菌标准培育温度:3035: 1cfu/ 皿碟号1 2 3 结果判定培育时间培育 48h 菌落数培育天数1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 培育基硫乙醇酸盐样品流体培育基阳性3035阴性胰酪大豆胨样品液体培育基2025阴性+” ,无菌生长就填“-”注:逐日观看,集菌器中有菌生长就填“结果判定 :本品按无菌检查标准操作规程依法检查,结果名师归纳总结 检验人 /日期:复核人 /日期:第 9 页,共 11 页- -
22、 - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 无菌检查原始记录直接接种法检验编号:产品名称年月日型号规格产品数量月日产品批号灭菌批号灭菌有效期来源检品数量检验日期年完成日期检验依据无菌检查标准操作规程检验结果第一页培育基:硫乙醇酸盐流体培育基配制批号:胰酪大豆胨液体培育基配制批号:稀释液、冲洗液: 0.1%蛋白胨水溶液 PH7.0 氯化钠 -蛋白胨缓冲液 0.9%无菌氯化钠溶液 其他配制批号:1mlcfu/ml 阳性对比菌菌液: 取对比菌新奇培育物,接种至适量的0.9%无菌氯化钠溶液中,取进行 10 倍系列稀释,取稀释液作为对比菌液;对比菌名称:代数:计数结果:仪器设备
23、: MJX-150 霉菌培育箱 SPX-150 生化培育箱2025 仪器编号:3035仪器编号:净化工作台环境监测温度:1 湿度:% 沉降菌标准培育温度:3035: 1cfu/ 皿碟号2 3 结果判定培育时间培育 48h 菌落数培育基培育天数1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 管号1 2 3 硫乙醇酸盐 流体培育基30354 5 6 7 8 注: 逐日观看,有菌生长就填“+” ,无菌生长就填“-”第 1 页 共 2 页名师归纳总结 - - - - - - -第 10 页,共 11 页精选学习资料 - - - - - - - - - 无菌检查原始记录直接接种法检验编号:产品名称年月日型号规格产品数量月日产品批号灭菌批号灭菌有效期来源检品数量检验日期年完成日期检验依据无菌检查标准操作规程检验结果其次页培育基培育天数1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 管号9 硫乙醇酸盐 流体培育基303510 阳性阴性1 2 3 4 胰酪大豆胨 液体培育基20255 6 7 8 9 10 阴性注: 逐日观看,有菌生长就填“+” ,无菌生长就填“-”结果判定 :本品按无菌检查标准操作规程依法检查,结果检验人 /日期:复核人 /日期:第 2 页 共 2 页名师归纳总结 - - - - - - -第 11 页,共 11 页
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