移植免疫及免疫学检测精品文稿.ppt
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1、移植免疫及免疫学检测第1页,本讲稿共56页移植(移植(transplantationtransplantation):将健康细胞、组织或器将健康细胞、组织或器官从其原部位移植到自体或异体的一定部位、用以官从其原部位移植到自体或异体的一定部位、用以替代或补偿机体所丧失的结构和(或)功能的现代替代或补偿机体所丧失的结构和(或)功能的现代医疗手段。医疗手段。移植物(移植物(graftgraft)供供 体(体(donordonor)受受 体(体(recipientrecipient)或宿主()或宿主(hosthost)概 述第2页,本讲稿共56页 自体移植自体移植根据移植物来源根据移植物来源 同系移植
2、同系移植 同种异体移植同种异体移植 异种移植异种移植 原位移植原位移植根据移植部位根据移植部位 异位移植异位移植 器官移植器官移植移植物种类移植物种类 支架组织移植支架组织移植 细胞移植细胞移植移植的类型移植的类型第3页,本讲稿共56页组织器官移植种类和命名 移植名称移植名称 供者、受者关系供者、受者关系 举例举例 自体移植自体移植 同一个体同一个体 自体断肢再植,自体皮片移植自体断肢再植,自体皮片移植 同系或同基因移植同系或同基因移植 同系或同基因同系或同基因 人的单卵双生子间的器官移植人的单卵双生子间的器官移植 的个体间的个体间 同品系小鼠的皮片移植同品系小鼠的皮片移植 同种异基因移植同种
3、异基因移植 同种不同基因同种不同基因 人与人之间的肾移植人与人之间的肾移植 的个体间的个体间 不同品系小鼠间的皮片移植不同品系小鼠间的皮片移植 异种移植异种移植 异种动物间异种动物间 狗的器官移植给猩猩狗的器官移植给猩猩 猪的器官移植给狗猪的器官移植给狗 第4页,本讲稿共56页第一节 引起排斥反应的靶抗原第5页,本讲稿共56页1 1 主要组织相容性抗原主要组织相容性抗原人人 HLA HLA 鼠鼠 H-2 H-2遗传特征:遗传特征:单倍型遗传单倍型遗传高度多态性高度多态性2 2 次要组织相容性抗原次要组织相容性抗原 主要组织相容性抗原(MHC分子)第6页,本讲稿共56页 父父 母母 HLAHLA
4、是人体多态性最丰富的是人体多态性最丰富的基因系统。据基因系统。据19991999年的统计,年的统计,HLAHLA复合物等位基因总数已达复合物等位基因总数已达到到10311031个,其中个,其中HLA-BHLA-B等位基等位基因有因有301301个个 A9Cw3B7A2Cw2B13A1Cw1B5A3Cw4B8HLAHLA的遗传特征的遗传特征第7页,本讲稿共56页第二节 排斥反应的种类及发生机制第8页,本讲稿共56页移植排斥反应(transplantation rejection)针针对对移移植植抗抗原原产产生生免免疫疫应应答答,从从而而导导致致移移植植物物功功能能丧丧失失或或受者机体损害的过程。
5、受者机体损害的过程。分类:分类:超急性排斥反应超急性排斥反应 急性排斥反应急性排斥反应 慢性排斥反应慢性排斥反应第9页,本讲稿共56页机制:机制:受受者者体体内内存存有有抗抗供供者者移移植植物物的的预预存存抗抗体体,与与抗抗原原结结合合,激激活补体和凝血系统活补体和凝血系统,导致血管内凝血。导致血管内凝血。预存抗体来源:预存抗体来源:1 1、供受者之间、供受者之间ABO ABO 血型不合;血型不合;2 2、受者反复多次输血、妊娠或既往作过移植。、受者反复多次输血、妊娠或既往作过移植。处理:重新移植处理:重新移植预防:预防:ABOABO血型配型、细胞毒实验血型配型、细胞毒实验1.1.超急性排斥反
6、应超急性排斥反应 第10页,本讲稿共56页2.2.急性排斥反应急性排斥反应 体液性排斥体液性排斥 抗体激活补体,并有抗体激活补体,并有CD4CD4+T T 细胞参与,导致急性血管炎细胞参与,导致急性血管炎细胞性排斥细胞性排斥 CD8 CD8+CTLCTL细胞的细胞毒作用、细胞的细胞毒作用、CD4CD4+T T和巨噬细胞的作用,导致急性间质炎。和巨噬细胞的作用,导致急性间质炎。处理处理 使用免疫抑制剂使用免疫抑制剂第11页,本讲稿共56页在急性排斥反应中的两条抗原提呈途径:在急性排斥反应中的两条抗原提呈途径:直直接接途途径径(direct direct pathpath):残残留留于于供供者者移
7、移植植物物内内的的抗抗原原提提呈呈细细胞胞(过过客客细细胞胞)对对受受者者机机体体的的免免疫疫系系统统提提供供最最初初的的抗抗原原刺刺激激。这这种种抗抗原原性性刺刺激激,来来自自移移植植物物中中树树突突状状细细胞胞和和单单核核细细胞胞等等表表面面富富含的含的HLA-HLA-、-类分子类分子 间间接接途途径径 (indirect indirect pathpath):通通过过受受者者体体内内的的抗抗原原提提呈呈细细胞胞对对具具有有同同种种异异基基因因HLA-HLA-、-类类分分子子的的移移植植物物实实质质细细胞胞的的识识别别。无无论论是是供供者者还还是是受受者者,其其抗抗原原提提呈呈细细胞胞提提
8、供供的的IL-1IL-1、IL-6IL-6等等刺刺激激信号,有助于触发淋巴细胞的活化信号,有助于触发淋巴细胞的活化 第12页,本讲稿共56页同种移植排斥反应的发生机制同种移植排斥反应的发生机制 第13页,本讲稿共56页慢性排斥反应的介导因素:慢性排斥反应的介导因素:T T细胞、巨噬细胞等介导的迟发型超敏反应等免疫损伤。细胞、巨噬细胞等介导的迟发型超敏反应等免疫损伤。B B细胞产生的抗体活化补体或通过细胞产生的抗体活化补体或通过ADCCADCC破坏血管内皮细胞。破坏血管内皮细胞。急性排斥反应反复发作所导致的移植物组织退行性变,此与细胞急性排斥反应反复发作所导致的移植物组织退行性变,此与细胞 和体
9、液免疫均有关系。和体液免疫均有关系。非免疫相关因素,诸如局部缺血、再灌注损伤、微生物感染等。非免疫相关因素,诸如局部缺血、再灌注损伤、微生物感染等。受者患有高血压或糖尿病也可促使慢性排斥反应的发生受者患有高血压或糖尿病也可促使慢性排斥反应的发生临床特征:临床特征:对免疫抑制疗法不敏感对免疫抑制疗法不敏感无特异性治疗方法,无特异性治疗方法,最终需要重新进行器官移植最终需要重新进行器官移植 3.3.慢性排斥反应慢性排斥反应第14页,本讲稿共56页定定义义:在在骨骨髓髓移移植植时时,供供者者骨骨髓髓中中的的免免疫疫细细胞胞启启动动以以受受者者细细胞胞为为靶靶抗抗原原的的免免疫疫应应答答反反应应,引引
10、起起攻攻击击受受者者的的移移植植物物抗抗宿主反应。宿主反应。GVHDGVHD也可见于脾、胸腺和小肠移植。也可见于脾、胸腺和小肠移植。发生机制:发生机制:T T细胞起主要作用细胞起主要作用 IL-2 IL-2、IL-6IL-6、TNF-TNF-、IFN-IFN-等等 ICAM ICAM、VCAMVCAM、CD44CD44、ELAM-1ELAM-1等等4.4.移植物抗宿主反应移植物抗宿主反应第15页,本讲稿共56页第三节 HLA分型方法第16页,本讲稿共56页血清学分型法应应用用一一系系列列已已知知抗抗HLAHLA的的特特异异性性标标准准分分型型血血清清与与待待测测淋淋巴巴细细胞胞混混合合,借借助
11、助补补体体的的生物学作用介导细胞裂解的细胞毒试验。生物学作用介导细胞裂解的细胞毒试验。操作简便易行、操作简便易行、节约试剂、结果可靠、重复性好节约试剂、结果可靠、重复性好 无需特殊设备无需特殊设备 耗时长耗时长不同批号抗血清结果常有不同不同批号抗血清结果常有不同第17页,本讲稿共56页用于用于HLAHLA分型的微量细胞毒试验分型的微量细胞毒试验 第18页,本讲稿共56页血清学分型法血清学分型法死(着染)细胞(死(着染)细胞(%)记分记分结果判断结果判断0 010101 1阴性阴性111120202 2可疑阴性可疑阴性212150504 4弱阳性弱阳性515180806 6阳性阳性80808 8
12、强阳性强阳性0 0未试验或不能读数未试验或不能读数第19页,本讲稿共56页第20页,本讲稿共56页细胞学分型法 以混合淋巴细胞培养以混合淋巴细胞培养(mixed lymphocyte culture,MLCmixed lymphocyte culture,MLC)或称混合淋巴细胞反应或称混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction,MLRmixed lymphocyte reaction,MLR)为基本技术的为基本技术的HLAHLA分型法。能用本法测定的分型法。能用本法测定的抗原称为抗原称为LDLD抗原抗原(lymphocyte defined antigenlymph
13、ocyte defined antigen),包括包括HLA-DHLA-D、-DP-DP。1.1.单向单向MLCMLC原理:将已知原理:将已知HLAHLA型别的分型细胞用丝裂霉素型别的分型细胞用丝裂霉素C C或或X X线照射预处理,使其失去增殖能力仅作为刺激线照射预处理,使其失去增殖能力仅作为刺激细胞;而以具有增殖能力的受检者外周血单个核细胞为反应细胞。两者混合培养时,反应细胞细胞;而以具有增殖能力的受检者外周血单个核细胞为反应细胞。两者混合培养时,反应细胞可对刺激细胞发生应答而增殖,用可对刺激细胞发生应答而增殖,用3H-TdR3H-TdR掺入法测定细胞增殖强度,从而判断受检细胞的掺入法测定细
14、胞增殖强度,从而判断受检细胞的HLAHLA型型别。别。根据选用的刺激细胞类型分为:根据选用的刺激细胞类型分为:1 1阴性分型法阴性分型法 2 2阳性分型法阳性分型法 第21页,本讲稿共56页 遗遗传传型型不不同同的的两两个个个个体体淋淋巴巴细细胞胞在在体体外外混混合合培培养养时时,由由于于两两者者HLAHLA不不同同,能能相相互互刺刺激激导导致致对对方方淋淋巴巴细细胞胞增增殖殖,故故称称双双向向MLCMLC。在在此此试试验验中中,各各自自的的淋淋巴巴细细胞胞既既是是刺刺激激细细胞胞,又又是是反反应应细细胞胞,反反应应后后形形态态上上呈呈现现的的细细胞胞转转化化和和分分裂裂现现象象,可可通通过过
15、形形态态法计数转化细胞法计数转化细胞。2.2.双向双向MLCMLC第22页,本讲稿共56页分子生物学分型法限限制制性性片片断断长长度度多多态态性性(restriction restriction fragment fragment length length polymorphism,polymorphism,RFLPRFLP)分析:分析:最早建立的研究最早建立的研究HLAHLA多态性的多态性的DNADNA分型技术分型技术 PCR-RFLPPCR-RFLP分分型型法法:对对DNADNA片片段段进进行行体体外外扩扩增增,然然后后再再用用限限制制性性内内切切酶酶进进行行酶酶切切分分析析,可使限制性
16、长度分析的敏感度大大增加可使限制性长度分析的敏感度大大增加1.RFLP1.RFLP与与PCR-RFLPPCR-RFLP分型法分型法 第23页,本讲稿共56页 序序列列特特异异性性寡寡核核苷苷酸酸-聚聚合合酶酶链链反反应应(PCR-sequence PCR-sequence specific specific oligonucleotide,oligonucleotide,PCR-SSOPCR-SSO)是是以以PCRPCR为为基基础础,将将凝凝胶胶上上扩扩增增的的HLAHLA基基因因DNADNA转转移移至至硝硝酸酸纤纤维维膜膜或或尼尼龙龙膜膜,进进而而用用放放射射性性核核素素或或酶酶、地地高高辛
17、辛等等非非放放射射性性物物质质标标记记的的寡寡核核苷苷酸酸探探针针与与之之进进行行杂杂交交,从从而而对对扩扩增增产产物物作作出出HLAHLA型别判断。型别判断。分类:分类:斑斑点点或或印印渍渍法法:用用扩扩增增的的待待测测DNADNA印印渍渍或或点点至至固固相相支支持持物物,再再与与探探针针行行杂杂交交,利利于于大大量量标标本本分型分型反反向向斑斑点点或或印印渍渍法法:将将已已知知DNADNA印印渍渍或或点点至至固固相相支支持持物物,然然后后与与扩扩增增的的待待测测DNADNA(预预先先标标记)杂交,用于少量标本分型记)杂交,用于少量标本分型 PCR-SSOPCR-SSO是是类类HLAHLA分
18、型应用最广泛的方法,分型应用最广泛的方法,能够鉴定所有已知序列的能够鉴定所有已知序列的HLA-DRHLA-DR、DQDQ、DPDP等位基因等位基因 2.PCR-SSO2.PCR-SSO分型法分型法 第24页,本讲稿共56页基基因因芯芯片片(gene(gene chip)chip)是是近近年年发发展展起起来来的的一一项项新新技技术术,将将其其与与PCR-SSOPCR-SSO结结合合应应用用于于HLAHLA分分型型,可可使使分分型型趋趋于于规规模模化化和和自自动动化化,尤尤其其在在HLAHLA多多态态性性和和疾疾病病遗遗传传背背景景分分析析等等方方面面更更具具优优势势。HLAHLA的的基基因因芯芯
19、片片分分型型法法,实实际际上上是是PCR-SSOPCR-SSO反反向向斑斑点点或或印印渍渍法法的的微微型型化化。目前,基因芯片在目前,基因芯片在HLAHLA分型领域的应用尚属起步阶段。分型领域的应用尚属起步阶段。2.PCR-SSO2.PCR-SSO分型法分型法 第25页,本讲稿共56页原原理理:应应 用用 设设 计计 的的 一一 套套 HLAHLA等等 位位 基基 因因 的的序序 列列 特特 异异 性性 引引 物物(sequence sequence specific specific primer,SSPprimer,SSP),对待测对待测DNADNA进行进行PCRPCR扩增,从而获得扩增,
20、从而获得HLAHLA型别特异性的扩增产物型别特异性的扩增产物HLAHLA基因扩增的特异性包括:基因扩增的特异性包括:座位特异性(座位特异性(locus-specificlocus-specific),如,如HLA-AHLA-A、B B、-DRB1-DRB1等;等;组特异性(组特异性(group-specificgroup-specific),如,如DRB1-01DRB1-01、DRB1-02DRB1-02等;等;等位基因特异性(等位基因特异性(allele-specificallele-specific),如,如DRB1*0401DRB1*0401、DRB1*0402DRB1*0402等。等。
21、3.PCR-SSP3.PCR-SSP分型法分型法 第26页,本讲稿共56页单单链链构构象象特特异异性性聚聚合合酶酶链链反反应应(PCR-single PCR-single strand strand conformation conformation polymorphism,PCR-polymorphism,PCR-SSCPSSCP)是以对待测基因是以对待测基因PCRPCR扩增为基础,对扩增的单链扩增为基础,对扩增的单链DNADNA(ssDNAssDNA)的)的HLAHLA分型方法。分型方法。原原理理:对对ssDNAssDNA进进行行无无变变性性剂剂的的聚聚丙丙烯烯酰酰凝凝胶胶电电泳泳时时,
22、因因其其序序列列的的差差异异可可形形成成不不同同的的空空间间构构象象而而导导致致电电泳泳迁迁移移率率的的差差异异,如如此此可可分分辨辨出出单单一一碱碱基基的的差差异异和和检检测测出出DNADNA多多态态性性或或点点突突变变,有有助助于于新新的的HLAHLA等位基因或突变体的发现。等位基因或突变体的发现。特特点点:PCR-SSCPPCR-SSCP作作为为PCR-SSOPCR-SSO的的补补充充,在在区区分分纯纯合合子子和和杂杂合合子子基基因因方方面面有有其其独独到到之之处处,有有利利于于排排除除SSOSSO杂交的假性。杂交的假性。4.PCR-SSCP4.PCR-SSCP分型法分型法 第27页,本
23、讲稿共56页基基于于序序列列的的HLAHLA分分型型法法(sequence-based sequence-based HLA HLA typing,SBTtyping,SBT),通通过过对对扩扩增增后后的的HLAHLA基基因因片片段段通过核酸序列测定来判断通过核酸序列测定来判断HLAHLA型别。型别。基基本本过过程程:分分离离待待测测细细胞胞的的DNADNA,应应用用座座位位、组组或或等等位位基基因因特特异异性性引引物物进进行行PCRPCR扩扩增增,扩扩增增产物的纯化和测序,测出的基因序列与产物的纯化和测序,测出的基因序列与HLAHLA基因库的基因库的DNADNA已知序列比较,判断待测的已知序
24、列比较,判断待测的HLAHLA型别。型别。5.SBT5.SBT分型法分型法 第28页,本讲稿共56页第四节 常见的组织或器官移植第29页,本讲稿共56页肾脏移植肾脏移植,创始于肾脏移植,创始于19501950年,是临床开展最早、应用最多和效果最佳的一种器官移植。年,是临床开展最早、应用最多和效果最佳的一种器官移植。1.1.组织配型在肾脏移植中的应用组织配型在肾脏移植中的应用 组织配型组织配型是肾脏移植前选择供者的重要手段是肾脏移植前选择供者的重要手段 ABO ABO血型配型、血型配型、HLA HLA配型和配型和 交叉配型交叉配型肾源选择的原则肾源选择的原则 以以ABOABO血型完全相同者为好,
25、至少能够相容血型完全相同者为好,至少能够相容 选择最佳选择最佳HLAHLA配型的供者器官配型的供者器官第30页,本讲稿共56页2.2.肾移植受者的疗效检测肾移植受者的疗效检测 疗效监测:疗效监测:受者免疫状态检测受者免疫状态检测临床观测项目临床观测项目:T T细细胞胞总总数数、CD4/CD8CD4/CD8比比值值和和IL-2IL-2及及其其受受体体的的检检测测,判判断断排排斥斥反反 应的发生和评估免疫抑制剂治疗效果应的发生和评估免疫抑制剂治疗效果 肾组织活检,预测排斥反应的发生肾组织活检,预测排斥反应的发生 CsA CsA血药浓度检测,指导合理用药,减少肾毒性血药浓度检测,指导合理用药,减少肾
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