第八章色谱法原理.优秀PPT.ppt
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1、第八章第八章 色谱法原理色谱法原理(Principles of Chromatography)第一节第一节 概述概述 一、色谱法简介一、色谱法简介 色谱法(色谱法(Chromatography)是一种分)是一种分别分析方法。它是利用各物质在两相中具别分析方法。它是利用各物质在两相中具有不同的安排系数,当两相作相对运动时,有不同的安排系数,当两相作相对运动时,这些物质在两相中进行多次反复的安排来这些物质在两相中进行多次反复的安排来达到分别的目的。达到分别的目的。色谱法早在色谱法早在1903年由俄国植物学家年由俄国植物学家Tswett分别植物色素时接受。后来不仅用分别植物色素时接受。后来不仅用于分
2、别有色物质,还用于分别无色物质,于分别有色物质,还用于分别无色物质,并出现了种类繁多的各种色谱法。很多气并出现了种类繁多的各种色谱法。很多气体、液体和固体样品都能找到合适的色谱体、液体和固体样品都能找到合适的色谱法进行分别和分析。目前色谱法已广泛应法进行分别和分析。目前色谱法已广泛应用于很多领域,成为特别重要的分别分析用于很多领域,成为特别重要的分别分析手段。手段。色谱分别过程色谱分别过程123在色谱发展史上占有重要地位的英国人在色谱发展史上占有重要地位的英国人A.J.P.Martin(马丁)(马丁)和和R.L.M.Synge(辛格),他们提精彩谱塔板理论;独创液(辛格),他们提精彩谱塔板理论
3、;独创液-液液安排色谱;预言了气体可作为流淌相(即气相色谱)。安排色谱;预言了气体可作为流淌相(即气相色谱)。1952年,因为他们对安排色谱理论的贡献获诺贝尔化学奖。年,因为他们对安排色谱理论的贡献获诺贝尔化学奖。R.L.M.Synge(1914-1994)A.J.P.MARTIN.(1910-2002)色谱法其共同的基本特点是具备两相:不动的一相,称为固定相;另一相是携带样品流过固定相的流淌体,称为流淌相。当流淌相中样品混合物经过固定相时,就会与固定相发生作用,由于各组分在性质和结构上的差异,与固定相相互作用的类型、强弱也有差异,因此在同一推动力的作用下,不同组分在固定相滞留时间长短不同,从
4、而按先后不同的次序从固定相中流出。组分分别示意图组分分别示意图 流淌相流淌相 检测器检测器 记录仪记录仪A+BABABBAABBA 二、色谱法分类二、色谱法分类 1按两相状态分类按两相状态分类 气气 体体 为为 流流 淌淌 相相 的的 色色 谱谱 称称 为为 气气 相相 色色 谱谱(GC),依依据据固固定定相相是是固固体体吸吸附附剂剂还还是是固固定定液液(附附着着在在惰惰性性载载体体上上的的一一薄薄层层有有机机化化合合物物液液体体),又可分为气固色谱(又可分为气固色谱(GSC)和气液色谱()和气液色谱(GLC)。)。液液体体为为流流淌淌相相的的色色谱谱称称液液相相色色谱谱(LC),同同理理,液
5、液相相色色谱谱亦亦可可分分为为液液固固色色谱谱(LSC)和和液液液色谱(液色谱(LLC)。)。超超临临界界流流体体为为流流淌淌相相的的色色谱谱称称为为超超临临界界流流体体色谱(色谱(SFC)。)。通通过过化化学学反反应应将将固固定定液液键键合合到到载载体体表表面面,这这种种化化学学键键合合固固定定相相的的色色谱谱又又称称化化学学键键合合相相色色谱谱(CBPC)。)。2按分别机理分类按分别机理分类 利用组分在吸附剂(固定相)上的吸附实力强弱不同而得以分别的方法,称为吸附色谱法。利用组分在固定液(固定相)中溶解度不同而达到分别的方法称为安排色谱法。利用组分在离子交换剂(固定相)上的亲和力大小不同而
6、达到分别的方法,称为离子交换色谱法。利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分别的方法,称为凝胶色谱法或尺寸排阻色谱法。最近,又有一种新分别技术,利用不同组分与固定相(固定化分子)的高专属性亲和力进行分别的技术称为亲和色谱法,常用于蛋白质的分别。3按固定相的外形分类按固定相的外形分类 固定相装于柱内的色谱法,称为固定相装于柱内的色谱法,称为固定相装于柱内的色谱法,称为固定相装于柱内的色谱法,称为柱色谱柱色谱柱色谱柱色谱,柱色谱,柱色谱,柱色谱,柱色谱又可分为又可分为又可分为又可分为填充柱色谱和开管柱色谱填充柱色谱和开管柱色谱填充柱色谱和开管柱色谱填充柱色谱和开管柱色谱。固定相呈平板状的
7、色谱法,称为固定相呈平板状的色谱法,称为固定相呈平板状的色谱法,称为固定相呈平板状的色谱法,称为平板色谱平板色谱平板色谱平板色谱,它又,它又,它又,它又可分为可分为可分为可分为薄层色谱和纸色谱薄层色谱和纸色谱薄层色谱和纸色谱薄层色谱和纸色谱。三、色谱法的特点三、色谱法的特点1 1、高高选选择择性性;2 2、高高效效能能;3 3、高高灵灵敏敏度度可可以以分分析析质质量量分分数数为为10-610-610-910-9数数量量级级、检检出出限限量量低低至至10-1lg10-1lg的的物物质质,适适于于微量和痕量分析。微量和痕量分析。四、色谱法的应用四、色谱法的应用1 1、色谱分析广泛应用于极为困难的混
8、合物成分分析;、色谱分析广泛应用于极为困难的混合物成分分析;2 2、液液相相色色谱谱法法,在在糖糖类类、氨氨基基酸酸、农农药药、染染料料、贵贵金金属属、有机金属化合物等方面得到了广泛的应用。有机金属化合物等方面得到了广泛的应用。3 3、色色谱谱分分别别是是一一种种特特别别有有效效的的提提纯纯物物质质的的技技术术,常常用用于于制制备分别,得到高纯样品。备分别,得到高纯样品。4 4、色谱、色谱质谱联用仪已成为探讨分子结构的重要手段。质谱联用仪已成为探讨分子结构的重要手段。其次节其次节 色谱流出曲线及有关术语色谱流出曲线及有关术语一色谱流出曲线一色谱流出曲线 从色谱柱先后流出的各组分进入从色谱柱先后
9、流出的各组分进入检检测器,检测测器,检测器产生响应信号,信号大小与组分浓度成正比,该器产生响应信号,信号大小与组分浓度成正比,该信号放大后输送到记录仪,信号放大后输送到记录仪,记录仪所画出的与样品记录仪所画出的与样品浓度相关的曲线就称为色谱流出曲线。浓度相关的曲线就称为色谱流出曲线。色色谱谱图图色谱峰保留时间基线峰宽 二、基线 当仪器中没有注入样品,仅有流淌相通过时,检测器响应信号的记录值,即图中Ot线。稳定的基线应当是一条水平直线。三、峰高 色谱峰顶点与基线之间的垂直距离,以h表示,如图中B A。四、保留值四、保留值 1死时间死时间tM 不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱不被固定相吸附或溶解
10、的物质进入色谱柱时,从进样到出现峰极大值所需的时间称为死柱时,从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间,如图中时间,如图中 OA。因为这种物质不被固定相。因为这种物质不被固定相吸附或溶解,故其流淌速度将与流淌相的流淌速吸附或溶解,故其流淌速度将与流淌相的流淌速度相近测定流淌相平均线速度相近测定流淌相平均线速时,可用柱长时,可用柱长L与与tM的比值计算。的比值计算。2保留时间保留时间tR 试样从进样起先到柱后出现峰极大点时所试样从进样起先到柱后出现峰极大点时所经验的时间,称为保留时间,如图中经验的时间,称为保留时间,如图中OB它它相当于样品到达柱末端的检测器所需的时间相当于样品到达柱末端的检测器
11、所需的时间 3调整保留时间调整保留时间tR 某组份的保留时间扣除死时间后称为该组份的调整某组份的保留时间扣除死时间后称为该组份的调整某组份的保留时间扣除死时间后称为该组份的调整某组份的保留时间扣除死时间后称为该组份的调整保留时间,即保留时间,即保留时间,即保留时间,即t tR R =t=tR R-t-tMM 由于组份在色谱柱中的保留时间tR包含了组份随流淌相通过柱子所需的时间和组份在固定相中滞留所需的时间,所以tR事实上是组份在固定相中停留的时间保留时间可用时间单位(如s)或距离单位(如cm)表示。保留时间是色谱法定性的基本依据,但同一组份的保留时间常受到流淌相流速的影响,因此色谱工作者有时用
12、保留体积等参数进行定性检定。4死体积死体积 VM 指指色色谱谱柱柱在在填填充充后后,柱柱管管内内固固定定相相颗颗粒粒间间所所剩剩留留的的空空间间、色色谱谱仪仪中中管管路路和和连连接接头头间间的的空空间间以以及及检检测测器器的的空空间间的的总总和和当当后后两两项项很很小小而而可可忽忽视视不不计计时时,死死体体积积可可由死时间与流淌相体积流速由死时间与流淌相体积流速F0(Lmin)计算:)计算:VM=tMF0 5保留体积保留体积 VR 指从进样起先到被测组份在柱后出现浓度极指从进样起先到被测组份在柱后出现浓度极大点时所通过的流淌相体积。保留体积与保留时大点时所通过的流淌相体积。保留体积与保留时间间
13、tR的关系如下:的关系如下:VR=tRF0 6调整保留体积调整保留体积VR 某某组组份份的的保保留留体体积积扣扣除除死死体体积积后后,称称该该组组份份的的调调整保留体积,即整保留体积,即 VR=VR-VM 7相对保留值相对保留值2.1 某某组组份份2的的调调整整保保留留值值与与组组份份1的的调调整整保保留留值值之之比比,称为相对保留值:称为相对保留值:由由于于相相对对保保留留值值只只与与柱柱温温及及固固定定相相的的性性质质有有关关,而而与与柱柱径径、柱柱长长、填填充充状状况况及及流流淌淌相相流流速速无无关关,因因此此,它它是是色色谱谱法法中中,特特殊殊是气相色谱法中,广泛运用的定性数据。是气相
14、色谱法中,广泛运用的定性数据。必必需需留留意意,相相对对保保留留值值确确定定不不是是两两个个组组份份保保留留时时间间或或保保留留体体积积之比之比.五、区域宽度五、区域宽度 色色谱谱峰峰的的区区域域宽宽度度是是组组份份在在色色谱谱柱柱中中谱谱带带扩扩张张的的函函数数,它它反反映映了了色色谱谱操操作作条条件件的的动动力力学学因因素素度度量量色色谱峰区域宽度通常有三种方法:谱峰区域宽度通常有三种方法:1.标准偏差标准偏差 正正态态分分布布曲曲线线两两侧侧拐拐点点之之间间距距离离的的一一半半,即即0.607倍倍峰高处色谱峰宽的一半,峰高处色谱峰宽的一半,如图中如图中EF距离的一半。距离的一半。2.半峰
15、宽半峰宽W1/2 即峰高一半处对应的峰宽,如图中即峰高一半处对应的峰宽,如图中GH间的距离。间的距离。它与标准偏差它与标准偏差的关系是:的关系是:W1/2=2.354 3.基线宽度基线宽度W 即即色色谱谱峰峰两两侧侧拐拐点点上上的的切切线线在在基基线线上上的的截截距距,如如图中图中IJ的距离。它与标准偏差的关系是:的距离。它与标准偏差的关系是:W=4 从色谱流出曲线上,可以得到很多重要信息:从色谱流出曲线上,可以得到很多重要信息:(l)依据色谱峰的个数,可以推断样品中所含组份的最少个数 (2)依据色谱峰的保留值(或位置),可以进行定性分析 (3)依据色谱峰的面积或峰高,可以进行定量分析 (4)
16、色谱峰的保留值及其区域宽度,是评价色谱柱分别效能的依据 (5)色谱峰两峰间的距离,是评价固定相(和流淌相)选择是否合适的依据 第三节第三节 色谱法分析的基本原理色谱法分析的基本原理两组份峰间距足够远:两组份峰间距足够远:由各组份在两相间的安排系数确定,即由色谱过程由各组份在两相间的安排系数确定,即由色谱过程的热力学性质确定。的热力学性质确定。每个组份峰宽足够小:每个组份峰宽足够小:由组份在色谱柱中的传质和扩散确定,即由色谱过由组份在色谱柱中的传质和扩散确定,即由色谱过程动力学性质确定。程动力学性质确定。因此,探讨、说明色谱分别行为应从热力学和动力因此,探讨、说明色谱分别行为应从热力学和动力学两
17、方面进行。学两方面进行。一、安排系数一、安排系数K K和安排比和安排比k k 1安排系数安排系数K 安排色谱的分别是基于样品组分在固定相和安排色谱的分别是基于样品组分在固定相和流淌相之间反复多次地安排过程,而吸附色谱的流淌相之间反复多次地安排过程,而吸附色谱的分别是基于反复多次地吸附一脱附过程。这种分分别是基于反复多次地吸附一脱附过程。这种分别过程常常用样品分子在两相间的安排来描述,别过程常常用样品分子在两相间的安排来描述,而描述这种安排的参数称为安排系数,它是指在而描述这种安排的参数称为安排系数,它是指在确定温度和压力下,组分在固定相和流淌相之间确定温度和压力下,组分在固定相和流淌相之间安排
18、达平衡时的浓度之比值,即安排达平衡时的浓度之比值,即 2.安排比安排比k 安排比又称容量因子,它是指在确定温度和压力下,组分在两相间安排达平衡时,安排在固定相和流淌相中的质量比。即 k k 值越大,说明组分在固定相中的量越多,相当于柱的值越大,说明组分在固定相中的量越多,相当于柱的值越大,说明组分在固定相中的量越多,相当于柱的值越大,说明组分在固定相中的量越多,相当于柱的容量大,因此又称安排容量或容量因子。容量大,因此又称安排容量或容量因子。容量大,因此又称安排容量或容量因子。容量大,因此又称安排容量或容量因子。它是衡量色谱柱对被分别组分保留实力的重要参数。它是衡量色谱柱对被分别组分保留实力的
19、重要参数。它是衡量色谱柱对被分别组分保留实力的重要参数。它是衡量色谱柱对被分别组分保留实力的重要参数。k k 值也确定于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、值也确定于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、值也确定于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、值也确定于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、柱压变更而变更,而且还与流淌相及固定相的体积有关。柱压变更而变更,而且还与流淌相及固定相的体积有关。柱压变更而变更,而且还与流淌相及固定相的体积有关。柱压变更而变更,而且还与流淌相及固定相的体积有关。式中CS,Cm分别为组分在固定相和流淌相的浓度;Vm为柱中流淌相的体积,近似等于死体积。Vs为柱中
20、固定相的体积,在各种不同的类型的色谱中有不同的含义。例如:在安排色谱中,Vs表示固定液的体积;在尺寸排阻色谱中,则表示固定相的孔体积。3.安排系数安排系数K与安排比与安排比k的关系的关系 其中其中称为相比率,它是反映各种色谱柱型特点的称为相比率,它是反映各种色谱柱型特点的又一个参数。又一个参数。例如,对填充柱,其例如,对填充柱,其值一般为值一般为635;对;对毛细管柱,其毛细管柱,其值为值为60600。二、塔板理论二、塔板理论 把色谱柱比作一个精馏塔,沿把色谱柱比作一个精馏塔,沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的安排行为,同时引入理在两相间的安排行为,同时引
21、入理论塔板数作为衡量柱效率的指标,论塔板数作为衡量柱效率的指标,即色谱柱是由一系列连续的、相等即色谱柱是由一系列连续的、相等的水平塔板组成。每一块塔板的高的水平塔板组成。每一块塔板的高度用度用H表示,称为塔板高度,简称表示,称为塔板高度,简称板高。板高。塔板理论假设:1.在柱内一小段长度H内,组分可以在两相间快速达到平 衡。这一小段柱长称为理论塔板高度H。2.以气相色谱为例,载气进入色谱柱不是连续进行的,而是脉动式,每次进气为一个塔板体积(Vm)。3.全部组分起先时存在于第0号塔板上,而且试样沿轴(纵)向扩散可忽视。4.安排系数在全部塔板上是常数,与组分在某一塔板上的量无关。简洁地认为:在每一
22、块塔板上,溶质在两相间很快达到安排平衡,然后随着流淌相按一个一个塔板的方式向前移动。对于一根长为L的色谱柱,溶质平衡的次数应为:n=L/H n称为理论塔板数。与精馏塔一样,色谱柱的柱效随理论塔板数n的增加而增加,随板高H的增大而减小。塔板理论指出:第一,当溶质在柱中的平衡次数,即理论塔板数n大于50时,可得到基本对称的峰形曲线。在色谱柱中,n值一般很大,如气相色谱柱的n约为103 106,因而这时的流出曲线可趋近于正态分布曲线。当当当当n n5050时,就可以得到对称的峰形曲线。时,就可以得到对称的峰形曲线。时,就可以得到对称的峰形曲线。时,就可以得到对称的峰形曲线。其次,当样品进入色谱柱后,
23、只要各组分在两相间的安排系数其次,当样品进入色谱柱后,只要各组分在两相间的安排系数有微小差异,经过反复多次安排平衡后,仍可获得良好的分别。有微小差异,经过反复多次安排平衡后,仍可获得良好的分别。第三,第三,n与半峰宽及峰底宽的关系式为:与半峰宽及峰底宽的关系式为:n=5.54(tr/W1/2)2=16(tr/W)2 从公式可以看出,在从公式可以看出,在tr 确定时,假如色谱峰很窄,则说明确定时,假如色谱峰很窄,则说明n越大,越大,H越小,柱效能越高。越小,柱效能越高。在实际工作中,由公式在实际工作中,由公式 n=L/H 和和n=5.54(tr/W1/2)2=16(tr/W)2 计算出来的的计算
24、出来的的n和和H值有时并不能充分地反映色谱柱的分别值有时并不能充分地反映色谱柱的分别效能,因为接受效能,因为接受tR计算时,没有扣除死时间计算时,没有扣除死时间tM,所以常用有效所以常用有效塔板数塔板数n有效表示柱效:有效表示柱效:n有效有效=5.54(tr /W1/2)2=16(tr /W)2 有效板高有效板高:H有效有效=L/n有效有效有关塔板理论的说明:有关塔板理论的说明:1)说明柱效时,必需注明该柱效是针对何种物质、固定)说明柱效时,必需注明该柱效是针对何种物质、固定 液种类及其含量、流淌相种类及流速、操作条件等;液种类及其含量、流淌相种类及流速、操作条件等;2)应定期对柱效评价,以防
25、柱效下降、延长柱寿命。)应定期对柱效评价,以防柱效下降、延长柱寿命。3)塔板理论描述了组分在柱内的安排平衡和分别过程、)塔板理论描述了组分在柱内的安排平衡和分别过程、导出流出曲线的数学模型、说明白流出曲线形态和位导出流出曲线的数学模型、说明白流出曲线形态和位 置、提出了计算和评价柱效的参数。置、提出了计算和评价柱效的参数。但但该该理理论论是是在在志志向向状状况况下下导导出出的的,未未考考虑虑分分子子扩扩散散因因素素、其它动力学因素对柱内传质的影响。因此它不能说明:其它动力学因素对柱内传质的影响。因此它不能说明:峰形为什么会扩张?峰形为什么会扩张?影响柱效的动力学因素是什么?影响柱效的动力学因素
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