生物光子学2-光子学与光谱学基础02概要知识分享.ppt
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1、生物光子学生物光子学2-2-光子学与光光子学与光谱学基学基础0202概要概要光在界面上的反射和折射:分别遵从光在界面上的反射和折射:分别遵从反射定律反射定律和和Snell定律定律;当光从光密(折射率大)介质入射到光疏(折射率小)介质当光从光密(折射率大)介质入射到光疏(折射率小)介质的界面时,发生光的部分反射和折射现象;当入射角大于临的界面时,发生光的部分反射和折射现象;当入射角大于临界角时,光线会停止进入光疏介质,而全部反射回光密介质,界角时,光线会停止进入光疏介质,而全部反射回光密介质,即发生即发生全反射全反射。光纤光纤若光疏介质是溶液,由于波动效应,有一部分光的能量会穿若光疏介质是溶液,
2、由于波动效应,有一部分光的能量会穿过界面渗透到溶液中,是一种非均匀波,叫做消逝波,也称过界面渗透到溶液中,是一种非均匀波,叫做消逝波,也称隐失波或隐失波或倏逝波倏逝波。其在第二介质中的有效进入深度约为一个。其在第二介质中的有效进入深度约为一个波长。波长。全内反射荧光显微术全内反射荧光显微术内容回顾内容回顾2光的本质光的本质波粒二象性波粒二象性;光是一种能在真空和介质中以波动形式传播的,由振动的电波光是一种能在真空和介质中以波动形式传播的,由振动的电波和磁波组成的电磁波,同时也是一种叫做光子的能量包和磁波组成的电磁波,同时也是一种叫做光子的能量包;凡是与光的传播有关的各种现象,如衍射、干涉和偏振
3、,必须凡是与光的传播有关的各种现象,如衍射、干涉和偏振,必须用用波动说波动说来解释,凡是与光和物质相互作用有关的各种现象,来解释,凡是与光和物质相互作用有关的各种现象,如物质的光吸收与发射、光电效应和光散射(康普顿效应),如物质的光吸收与发射、光电效应和光散射(康普顿效应),都必须用都必须用光子说光子说来解释来解释;波动波动性性参量(波长、频率、相位、速度)参量(波长、频率、相位、速度)粒子性参量(能量、动量)粒子性参量(能量、动量)内容回顾内容回顾3光波的干涉和衍射光波的干涉和衍射 l光的相干性:光的相干性:时间相干性、空间相干性时间相干性、空间相干性l产生干涉条件:产生干涉条件:只有两列光
4、波的只有两列光波的频率频率相同,相同,位相差位相差恒定,恒定,振动方向振动方向一一致的致的相干光源相干光源,才能产生光的干涉。,才能产生光的干涉。l当光遇到尖锐的障碍物、通过小孔和狭缝,或聚焦于尺寸与光波长相当光遇到尖锐的障碍物、通过小孔和狭缝,或聚焦于尺寸与光波长相近的斑点时,光弯折和扩散等衍射现象就会发生。近的斑点时,光弯折和扩散等衍射现象就会发生。l相长干涉产生亮纹,相消干涉产生暗纹。相长干涉产生亮纹,相消干涉产生暗纹。内容回顾内容回顾4光子的吸收、发射和散射光子的吸收、发射和散射;l光与分子的相互作用光与分子的相互作用过程:吸收、自发辐射、受激辐射、拉曼散射过程:吸收、自发辐射、受激辐
5、射、拉曼散射;l光子的吸收和发射过程用光子的吸收和发射过程用爱因斯坦(爱因斯坦(EinsteinEinstein)模型)模型描述描述。物质的物质的“波粒二象性波粒二象性”内容回顾内容回顾5波波长 (de Broglie波)波)h=Planck常数常数由由Schrdinger方程的解得出的方程的解得出的量子化能量量子化能量物物质 粒子行粒子行为似波行似波行为动能能动量量p=mv由由经经典牛典牛顿顿力学描述的力学描述的平平动动能量能量分子的能级结构:分子的能级结构:电子和振动能级电子和振动能级(量子化)在生物光子学中有重要的作用(量子化)在生物光子学中有重要的作用激发态的跃迁过程:激发态的跃迁过程
6、:有机分子的各种辐射和非辐射过程常用有机分子的各种辐射和非辐射过程常用Jablonski能级图能级图描述;描述;内容回顾内容回顾6S2S1T1S0EFluorescencePhosphorescenceVibrationalRelaxationVibrationalRelaxationICICISCISCAbsorption单单重重态态:S0,S1,S2三重三重态态:T1IC:内:内转转化化ISC:系:系间窜跃间窜跃荧荧光光磷光磷光光谱光谱电子在两个能级间的跃迁与振动耦合分子振动同时包含电子能级和振动能级改变的电子振动跃迁吸收,从低能态向受激态的跃迁发射,从高能态到低能态的跃迁磷光自旋不守恒荧
7、光自旋守恒拉曼散射散射一个可见光频域的光子从而导致振动能态的改变红外吸收吸收一个红外或远红外光子从而从一个低能态跃迁到高能态n生物光子学中用到的各种光生物光子学中用到的各种光谱谱7内容回顾内容回顾光光谱仪谱仪:棱:棱镜镜、光、光栅栅、FT-IR光光谱仪谱仪2.1 光在界面上的反射和折射光在界面上的反射和折射2.2 光的本光的本质波粒二象性波粒二象性2.3 光子的吸收、光子的吸收、发射和散射射和散射2.4 光波的干涉和衍射光波的干涉和衍射 2.5 分子能分子能级结构与光构与光谱 2.6 激光与非激光与非线性光学性光学本本 章章 内内 容容83、电子能级、电子能级吸收吸收光谱光谱电子能级吸收用于对
8、样品的定量分析,如电子能级吸收用于对样品的定量分析,如紫外紫外-可见光谱仪可见光谱仪测测量电子能级的线性吸收;量电子能级的线性吸收;线性吸收由线性吸收由Beer-Lambert定律定义定律定义,即一束初始强度为,即一束初始强度为I0频率为频率为v的入射光按指数衰减,即输出强度的入射光按指数衰减,即输出强度I为:为:系数系数(v)和和k(v)的单位为的单位为L mol-1cm-1;(v)比比k(v)更常用,称为更常用,称为频频率率v处的消光系数处的消光系数;b以以cm为单位,是光学路径长度为单位,是光学路径长度,定义为光通过吸收介质的路径,定义为光通过吸收介质的路径的长度;的长度;2.5 分子能
9、级结构与光谱分子能级结构与光谱 9n线性吸收过程线性吸收过程2.5 分子能级结构与光谱分子能级结构与光谱 10线性吸收由线性吸收由Beer-Lambert定律定义,即一束初始强度为定律定义,即一束初始强度为I0频频率为率为v的入射光按指数衰减,即初始强度的入射光按指数衰减,即初始强度I为:为:吸收率:吸收率:透射率:透射率:光学密度:光学密度:n另外一些描述吸收衰减的另外一些描述吸收衰减的参量参量:2.5 分子能级结构与光谱分子能级结构与光谱 11T和和OD考虑了光通过介质时由于吸收和散射而造成的总的强度考虑了光通过介质时由于吸收和散射而造成的总的强度损失;如果吸收占主导地位,则损失;如果吸收
10、占主导地位,则OD=A。电子能级吸收光谱电子能级吸收光谱典型的吸收光谱表示为典型的吸收光谱表示为T相对于相对于v或或 的曲线,或的曲线,或A相对相对于于v的曲线的曲线;v定义为吸收谱带最大吸收值一半处的宽带。定义为吸收谱带最大吸收值一半处的宽带。2.5 分子能级结构与光谱分子能级结构与光谱 12吸收光吸收光谱的两种表示的两种表示电子能级吸收光谱电子能级吸收光谱吸收光谱能够识别发色团;吸收光谱能够识别发色团;吸收频率可能与发色团的环境有关吸收频率可能与发色团的环境有关;如果已知发色团在频率如果已知发色团在频率v处的摩尔消光系数处的摩尔消光系数(v),则可以得到此发,则可以得到此发色团的浓度;色团
11、的浓度;生物介质中可能含有多种已知摩尔消光系数的吸收性发色团,通生物介质中可能含有多种已知摩尔消光系数的吸收性发色团,通过测量在一系列频率上的吸收率过测量在一系列频率上的吸收率A,可以得到各种不同发色团的浓,可以得到各种不同发色团的浓度。度。2.5 分子能级结构与光谱分子能级结构与光谱 13n乙醚中叶绿素乙醚中叶绿素a的吸收光谱的吸收光谱2.5 分子能级结构与光谱分子能级结构与光谱 14如图,在如图,在650nm处处的吸收与叶绿素的的吸收与叶绿素的绿色对应。因为,绿色对应。因为,红光的吸收产生绿红光的吸收产生绿色的透射或散射光色的透射或散射光(补色)。(补色)。nHPPH(光动力疗法中的一种药
12、物)的吸收光谱(光动力疗法中的一种药物)的吸收光谱2.5 分子能级结构与光谱分子能级结构与光谱 154、电子能级、电子能级发射发射光谱光谱研究从一个受激电子能态向一个较低电子能态(一般是基态)跃研究从一个受激电子能态向一个较低电子能态(一般是基态)跃迁而产生的光发射;迁而产生的光发射;室温下生物分子即有荧光现象;从一个三重受激态到单重态的磷室温下生物分子即有荧光现象;从一个三重受激态到单重态的磷光则在室温下很少观察到;光则在室温下很少观察到;单光子吸收产生了红移的荧光谱带;这种在吸收谱带的峰值与发单光子吸收产生了红移的荧光谱带;这种在吸收谱带的峰值与发射谱带的峰值之间的偏移称为射谱带的峰值之间
13、的偏移称为Stokes红移红移,吸收和发射光子之间,吸收和发射光子之间的能量差对应于非辐射过程的能量损失;的能量差对应于非辐射过程的能量损失;Stokes红移可能由环境效应造成,也可能是由于发射光子的受激红移可能由环境效应造成,也可能是由于发射光子的受激态的结合结构的改变造成的。态的结合结构的改变造成的。2.5 分子能级结构与光谱分子能级结构与光谱 16n荧光素的吸收和发射光谱荧光素的吸收和发射光谱2.5 分子能级结构与光谱分子能级结构与光谱 17荧光成像是生物光子学中主要的光学生物成像技荧光成像是生物光子学中主要的光学生物成像技术术。荧光光谱学包括如下特性的研究:荧光光谱学包括如下特性的研究
14、:荧光光谱技术荧光光谱技术荧光激发光谱荧光激发光谱荧光寿命荧光寿命荧光量子产额荧光量子产额荧光偏振荧光偏振2.5 分子能级结构与光谱分子能级结构与光谱 18荧光光谱技术荧光光谱技术(发射光谱)(发射光谱)光源:在单光子激发荧光中常用方便而强大的光源是光源:在单光子激发荧光中常用方便而强大的光源是激光器,并使用一个宽带滤波器只让高于发射光谱频激光器,并使用一个宽带滤波器只让高于发射光谱频率的光通过;率的光通过;这种情况下所得的荧光叫做这种情况下所得的荧光叫做激光诱导荧光激光诱导荧光(LIF););探测:作为频率函数的荧光强度所成的荧光光谱在一探测:作为频率函数的荧光强度所成的荧光光谱在一个包含有
15、一个分光器件的荧光光谱仪中得到;个包含有一个分光器件的荧光光谱仪中得到;分光器件:光栅、棱镜。分光器件:光栅、棱镜。2.5 分子能级结构与光谱分子能级结构与光谱 19荧光激发光谱荧光激发光谱(吸收光谱)(吸收光谱)激发光谱给出关于激发分子到一个产生最大荧光的能激发光谱给出关于激发分子到一个产生最大荧光的能态的信息;态的信息;激发光谱中的极大值对应于产生极大荧光的吸收的光激发光谱中的极大值对应于产生极大荧光的吸收的光子频率。子频率。2.5 分子能级结构与光谱分子能级结构与光谱 20n荧荧光光寿寿命命表表示示荧荧光光强强度度的的衰衰减减,是是指指分分子子受受到到光光脉脉冲冲激激发发后后返返回回基基
16、态态之之前前在在激激发发态态平平均均停停留留的的时时间间,通通常常小小于于100ns,它它主主要要依依赖赖于于被测荧光团所处的微环境变化被测荧光团所处的微环境变化。l荧光寿命荧光寿命2.5 分子能级结构与光谱分子能级结构与光谱 21一个简单的荧光衰减是单指数的,即一个简单的荧光衰减是单指数的,即I(t)是样品受到光脉冲激发后是样品受到光脉冲激发后t时刻测量得到的强度,时刻测量得到的强度,I0是是t=0时的时的强度,强度,k为衰减速率常数为衰减速率常数kr:辐射衰减常数:辐射衰减常数knr:非辐射衰减常数:非辐射衰减常数:荧光寿命荧光寿命通过实验测量并进行单指数拟合,得到总的通过实验测量并进行单
17、指数拟合,得到总的荧光寿命荧光寿命。n荧光寿命的两种测量方法:荧光寿命的两种测量方法:n时时域域测测量量:也也叫叫脉脉冲冲法法,它它是是用用高高重重复复频频率率超超短短光光脉脉冲冲激激发发样样品品,处处于于激激发发态态的的荧荧光光分分子子在在退退激激发发到到基基态态的的过过程程中中发发射射荧荧光释放能量,光释放能量,然后测量荧光然后测量荧光强度强度衰减。衰减。n频频域域测测量量:也也叫叫相相位位调调制制法法,它它是是用用强强度度按按正正弦弦规规律律调调制制的的激激光光激激发发样样品品,荧荧光光强强度度也也是是按按正正弦弦调调制制的的,且且二二者者调调制制频频率率相相同同,通通过过测测量量荧荧光
18、光相相对对于于激激发发光光的的相相位位差差及及解解调调系系数数来来计计算算荧光寿命值荧光寿命值。l荧光寿命荧光寿命2.5 分子能级结构与光谱分子能级结构与光谱 22荧光的量子产额荧光的量子产额荧光的量子产额是发射光子数与吸收光子数比率的一荧光的量子产额是发射光子数与吸收光子数比率的一种量度。在没有非辐射衰减时,量子产额等于种量度。在没有非辐射衰减时,量子产额等于1,即激,即激发态只以辐射(荧光)过程衰减;发态只以辐射(荧光)过程衰减;定义式:定义式:荧光的量子产额是测量分子聚合物中荧光团周围环境荧光的量子产额是测量分子聚合物中荧光团周围环境的最好手段。的最好手段。2.5 分子能级结构与光谱分子
19、能级结构与光谱 23荧光的偏振荧光的偏振荧光偏振定义为:荧光偏振定义为:另一种定义荧光偏振的量叫荧光发射的另一种定义荧光偏振的量叫荧光发射的各向异性各向异性r,定,定义为:义为:I/和和I 分别为极化方向与激发光的极化方向平行和垂直分别为极化方向与激发光的极化方向平行和垂直的荧光强度。的荧光强度。2.5 分子能级结构与光谱分子能级结构与光谱 245、振动能级光谱、振动能级光谱振动能级光谱给出振动频率信息;振动频率可提供有关振动能级光谱给出振动频率信息;振动频率可提供有关化学键、键角、化学集团的详细特征描述,可以用来识化学键、键角、化学集团的详细特征描述,可以用来识别分子。别分子。振动能级光谱包
20、括:振动能级光谱包括:红外光谱(吸收)红外光谱(吸收):吸收吸收一个红外或远红外光子会产生振动跃迁;一个红外或远红外光子会产生振动跃迁;拉曼光谱(散射)拉曼光谱(散射):通过拉曼:通过拉曼散射散射产生振动跃迁。产生振动跃迁。红外光谱和拉曼光谱是提供振动跃迁和振动能带信息的互补技术。红外光谱和拉曼光谱是提供振动跃迁和振动能带信息的互补技术。nphoton=nvibrationnI ns=nvibration2.5 分子能级结构与光谱分子能级结构与光谱 25振动能级光谱振动能级光谱拉曼散射:拉曼散射:入射和散射光子的能量差为分子振动入射和散射光子的能量差为分子振动能级差;能级差;Stokes拉曼散
21、射:拉曼散射:散射光子的频率低于入射光散射光子的频率低于入射光子子(vv),分子从低振动能级跃迁到高振,分子从低振动能级跃迁到高振动能级;动能级;反反Stokes拉曼散射:拉曼散射:散射光子的频率高于入射散射光子的频率高于入射光子光子(vv),分子从较高振动能级跃迁到较,分子从较高振动能级跃迁到较低振动能级;低振动能级;2.5 分子能级结构与光谱分子能级结构与光谱 26振振动动能能级级光光谱谱拉曼光拉曼光谱谱的的缺点缺点:拉曼散射的效率很低:一般来拉曼散射的效率很低:一般来说说,在,在105个光子中,只有一个个光子中,只有一个光子可以光子可以产产生散射。(因此使用激光作生散射。(因此使用激光作
22、为为光源)光源)拉曼光拉曼光谱谱比比IR光光谱谱的灵敏度低,因而在固的灵敏度低,因而在固态态、液、液态态或者不含水或者不含水的有机分子研究中,的有机分子研究中,经经常使用常使用IR光光谱谱来来获获得关于得关于结结构的构的详细详细信信息;息;如果被如果被测样测样品中具有自体品中具有自体荧荧光,光,则荧则荧光信号光信号强强度要比度要比Raman散散射信号大射信号大许许多数量多数量级级,因而背景,因而背景荧荧光会淹没光会淹没Raman谱带谱带。2.5 分子能级结构与光谱分子能级结构与光谱 27振振动动能能级级光光谱谱拉曼光拉曼光谱谱的的优优点点(相比于(相比于IR光光谱谱):):生物生物样样品品经经
23、常存在于水中;水常存在于水中;水对对IR的吸收率很大,而拉曼散射的吸收率很大,而拉曼散射很小,因此很小,因此拉曼光拉曼光谱对谱对于探于探测测水溶液中的生物水溶液中的生物样样品十分重要品十分重要;做拉曼散射前,被做拉曼散射前,被测样测样品无需特殊品无需特殊处处理理,可直接利用被,可直接利用被测样测样品品的自然形的自然形态态(液(液态态、固、固态态、胶状);、胶状);由于可由于可见见光波段的激光可以聚焦到微米量光波段的激光可以聚焦到微米量级级大小,因此可以大小,因此可以获获得得微米微米颗颗粒(比如一个粒(比如一个细细胞大小)的拉曼光胞大小)的拉曼光谱谱;利用与待利用与待测测分子最大吸收峰相近的激光
24、,通分子最大吸收峰相近的激光,通过过共振增共振增强强拉曼散拉曼散射射,可以,可以选择选择性地探性地探测测特定的化学片段或特定的化学片段或亚细亚细胞胞组组分。分。2.5 分子能级结构与光谱分子能级结构与光谱 28振动能级光谱振动能级光谱拉曼光谱的拉曼光谱的发展发展:紫外共振紫外共振Raman光谱光谱(230250nm的紫外激发);的紫外激发);表面增强表面增强Raman光谱术(光谱术(SERS):把分子沉淀在精微粗糙的:把分子沉淀在精微粗糙的金属、金属胶状物或金属纳米颗粒的表面,从而增强这种分子金属、金属胶状物或金属纳米颗粒的表面,从而增强这种分子的的Raman跃迁的强度;这种增强可达几个数量级
25、,金和银是跃迁的强度;这种增强可达几个数量级,金和银是增强效果最大的金属。增强效果最大的金属。2.5 分子能级结构与光谱分子能级结构与光谱 29n一些化学键的典型振动频率一些化学键的典型振动频率2.5 分子能级结构与光谱分子能级结构与光谱 30振动光谱在生物材料的结构特征识别和相互作用机振动光谱在生物材料的结构特征识别和相互作用机理的探索上有广泛的应用。理的探索上有广泛的应用。n固态的天然胰岛素和变性胰岛素的拉曼光谱固态的天然胰岛素和变性胰岛素的拉曼光谱2.5 分子能级结构与光谱分子能级结构与光谱 31n水化蛋白质膜的典型红外光谱水化蛋白质膜的典型红外光谱2.5 分子能级结构与光谱分子能级结构
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