细胞培养及次生代谢物生产.ppt
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1、第七章第七章细胞培养及次生代谢物的生产细胞培养及次生代谢物的生产 植物细胞培养的应用主要植物细胞培养的应用主要包括以下包括以下3 3个方面个方面:1 1、植物次生代谢产物的生产;、植物次生代谢产物的生产;2 2、植物体细胞无性系的快速繁殖和遗传突变体的筛选;、植物体细胞无性系的快速繁殖和遗传突变体的筛选;3 3、植物、植物细胞遗传、生理、生化和病毒方面的基础研究。细胞遗传、生理、生化和病毒方面的基础研究。植物细胞培养生产的化合物很多,包括糖类、酚类、脂类、植物细胞培养生产的化合物很多,包括糖类、酚类、脂类、蛋白质、核酸以及帖类和生物碱等初生和次生代谢产物蛋白质、核酸以及帖类和生物碱等初生和次生
2、代谢产物。第一节第一节 单细胞培养单细胞培养 一、单细胞的分离方法一、单细胞的分离方法(一一)机械法机械法:分离叶肉细胞是首先轻轻研碎叶片组织分离叶肉细胞是首先轻轻研碎叶片组织,然后过滤和离心净然后过滤和离心净化细胞化细胞;优点优点:1 1 细胞不受酶的伤害细胞不受酶的伤害;2 2不需要质壁分离不需要质壁分离;有利于进行生理生化研究有利于进行生理生化研究;缺点缺点:细胞结构易受到伤害细胞结构易受到伤害,获得完整的细胞数量低获得完整的细胞数量低;虽然此法分离的细胞能分裂并形成愈伤组织虽然此法分离的细胞能分裂并形成愈伤组织,但仍不普遍适用但仍不普遍适用;(二二)酶解法酶解法:利用利用果胶酶果胶酶,
3、纤维素酶纤维素酶处理,分离出具有代谢活性的细胞。处理,分离出具有代谢活性的细胞。不仅能降解中胶层,而且还能软化细胞壁,但在分离获得不仅能降解中胶层,而且还能软化细胞壁,但在分离获得细胞的过程中,必须对细胞给予渗透压保护。细胞的过程中,必须对细胞给予渗透压保护。(三(三 )从愈伤组织分离单细胞)从愈伤组织分离单细胞 首先通过组织培养的方法首先通过组织培养的方法,诱导外植体产生愈伤组织。接着诱导外植体产生愈伤组织。接着对愈伤组织对愈伤组织反复继代反复继代以增加愈伤组织的松散性。同时还要以增加愈伤组织的松散性。同时还要利用不利用不同的培养基同的培养基可以使愈伤组织具有不同的生长速度可以使愈伤组织具有
4、不同的生长速度,结构可松可紧结构可松可紧-愈伤组织分散成单细胞或很小的细胞团。愈伤组织分散成单细胞或很小的细胞团。将愈伤组织放在较高盐分将愈伤组织放在较高盐分,高生长素及高水解酪蛋白的培高生长素及高水解酪蛋白的培养基上培养养基上培养,然后移入液体培养基并经过搅拌而分散为单细胞然后移入液体培养基并经过搅拌而分散为单细胞,也可加入一些果胶酶也可加入一些果胶酶;但一般来说得到纯一的单细胞依然很少。但一般来说得到纯一的单细胞依然很少。操作步骤操作步骤:形成愈伤组织形成愈伤组织选择未分化和易散碎的愈伤组选择未分化和易散碎的愈伤组织织-转移到液体培养基中转移到液体培养基中-振荡培养振荡培养小细胞团或单细胞
5、。小细胞团或单细胞。二、单细胞培养方法二、单细胞培养方法 单细胞培养方法有三种:看护培养法、平板培养法、微室单细胞培养方法有三种:看护培养法、平板培养法、微室培养法。培养法。(一一)看护培养看护培养-把单个细胞置于一块活跃生长的愈伤组织把单个细胞置于一块活跃生长的愈伤组织(看看护组织护组织)上培养上培养,在愈伤组织与培养细胞间用一层滤纸相隔在愈伤组织与培养细胞间用一层滤纸相隔;看护看护愈伤组织的作用不仅给培养细胞提供营养成分,还提供能促进细愈伤组织的作用不仅给培养细胞提供营养成分,还提供能促进细胞分裂的物质,细胞分裂物质可通过滤纸而扩散。胞分裂的物质,细胞分裂物质可通过滤纸而扩散。应用看护培养
6、法建立单细胞无性系应用看护培养法建立单细胞无性系(二二)平板培养平板培养 将含有游离细胞或细胞团的悬浮培养物过滤,除去组织块将含有游离细胞或细胞团的悬浮培养物过滤,除去组织块和大细胞团,将液体培养基加入和大细胞团,将液体培养基加入0.61%0.61%的琼脂,融化,冷却到的琼脂,融化,冷却到35C35C,再将培养基与悬浮液等量混合,迅速注入并使之铺展在,再将培养基与悬浮液等量混合,迅速注入并使之铺展在培养皿培养皿(1mm(1mm厚厚)。35C35C温度下温度下,培养基保持液体状态,也不会杀培养基保持液体状态,也不会杀死细胞。封口死细胞。封口,25C,25C温度温度,黑暗中培养。可以定期镜检观察细
7、胞黑暗中培养。可以定期镜检观察细胞的生长情况。的生长情况。用平板培养技术获得单细胞无性系的程序用平板培养技术获得单细胞无性系的程序 (三三)微室培养法微室培养法 由悬浮培养物中取出一滴含单细胞的培养液由悬浮培养物中取出一滴含单细胞的培养液,置于一张无菌载置于一张无菌载玻片上的微室中进行培养玻片上的微室中进行培养,可以对细胞培养过程连续进行显微观可以对细胞培养过程连续进行显微观察察,了解细胞经过生长了解细胞经过生长,分裂分裂,分化分化,形成细胞团的全部过程。形成细胞团的全部过程。微室培养法示意图微室培养法示意图三、三、影响单细胞培养的因子影响单细胞培养的因子 初始细胞密度初始细胞密度(1 1)是
8、影响单细胞培养成败的关键因子。单是影响单细胞培养成败的关键因子。单细胞培养接种密度必须达到临界细胞密度细胞培养接种密度必须达到临界细胞密度(10(103 3个细胞毫升以个细胞毫升以上,一般细胞密度在上,一般细胞密度在10104 410105 5个细胞毫升)为宜,细胞密度个细胞毫升)为宜,细胞密度过低,不利于细胞的增殖,而细胞密度过高形成的细胞团混杂过低,不利于细胞的增殖,而细胞密度过高形成的细胞团混杂在一起,难于获得单细胞系。在一起,难于获得单细胞系。培养基的成培养基的成分分(2 2)是影是影响单细胞培养的又一关键因子。初响单细胞培养的又一关键因子。初始细胞密度的减小,细胞对培养基的要求就越高
9、,在培养基中始细胞密度的减小,细胞对培养基的要求就越高,在培养基中添加如椰子汁、水解酪蛋白或酵母浸出液等,则可有效地取代添加如椰子汁、水解酪蛋白或酵母浸出液等,则可有效地取代影响细胞分裂的高密度细胞的群体效应。在培养低密度植板假影响细胞分裂的高密度细胞的群体效应。在培养低密度植板假挪威械细胞时,必须在基本培养基中加入一种细胞分裂素、赤挪威械细胞时,必须在基本培养基中加入一种细胞分裂素、赤霉酸和几种氨基酸,而这些添加物并不是该种植物愈伤组织培霉酸和几种氨基酸,而这些添加物并不是该种植物愈伤组织培养所必须的。养所必须的。第二节第二节 细胞悬浮培养细胞悬浮培养 细胞悬浮培养是指将游离的单细胞或小的细
10、胞团(含少数细胞悬浮培养是指将游离的单细胞或小的细胞团(含少数细胞的分生细胞团或细胞聚集体)以一定的细胞密度接种到液体细胞的分生细胞团或细胞聚集体)以一定的细胞密度接种到液体培养基中于摇床上进行悬浮培养。用于培养的细胞或小的细胞团培养基中于摇床上进行悬浮培养。用于培养的细胞或小的细胞团来自愈伤组织,或某个器官或组织,通过物理或化学的方法进行来自愈伤组织,或某个器官或组织,通过物理或化学的方法进行分离而获得。分离而获得。细胞悬浮培养是一种有用的实验技术体系。一方面细胞可以细胞悬浮培养是一种有用的实验技术体系。一方面细胞可以不断增殖,形成高密度的细胞群体,适应于大规模培养,另一方不断增殖,形成高密
11、度的细胞群体,适应于大规模培养,另一方面悬浮培养能够得到大量的均匀的细胞,可以用来分离原生质、面悬浮培养能够得到大量的均匀的细胞,可以用来分离原生质、筛选突变体、人工种子生产、生产次生代谢物质以及进行植物细筛选突变体、人工种子生产、生产次生代谢物质以及进行植物细胞代谢生理、生化特征等方面的研究,为深入研究细胞的生长、胞代谢生理、生化特征等方面的研究,为深入研究细胞的生长、分化提供良好的条件。分化提供良好的条件。一、悬浮细胞培养的方法一、悬浮细胞培养的方法 细胞悬浮培养可分为细胞悬浮培养可分为分批培养分批培养和和连续培养连续培养1.1.分批培养分批培养 是指将一定量的初始培养细胞或小细胞团分散在
12、一定量的液是指将一定量的初始培养细胞或小细胞团分散在一定量的液体培养基中进行培养的方法。在培养过程中体培养基中进行培养的方法。在培养过程中,除了气体和挥发性代除了气体和挥发性代谢产物可以与外界空气交换外谢产物可以与外界空气交换外,一切都是密闭的。一切都是密闭的。所用容器一般为所用容器一般为100250ml100250ml三角瓶三角瓶,每瓶每瓶2075ml2075ml培养基培养基;为了使分批培养的细胞不断增殖为了使分批培养的细胞不断增殖,必须进行继代培养必须进行继代培养:取出培养瓶取出培养瓶中一小部分中一小部分(1/51/3)(1/51/3)的悬浮液的悬浮液,转移到含相同成分的新鲜培养基中转移到
13、含相同成分的新鲜培养基中;分批培养是植物细胞悬浮培养中常用的方法,分批培养是植物细胞悬浮培养中常用的方法,培养体系容易建立,重复性好,常常用于突变培养体系容易建立,重复性好,常常用于突变体筛选和遗传转化体系建立等方面的研究。体筛选和遗传转化体系建立等方面的研究。2.2.连续培养连续培养 利用特别的培养容器进行大规模细胞培养的一种培养方式利用特别的培养容器进行大规模细胞培养的一种培养方式;在连续培养的过程中在连续培养的过程中,不断注入新鲜培养基不断注入新鲜培养基,排出等体积的用过的培排出等体积的用过的培养基养基,培养液中的营养物质的到不断的补充培养液中的营养物质的到不断的补充,可调节注入与流出速
14、度可调节注入与流出速度,故培养的细胞生长速率相对一致故培养的细胞生长速率相对一致,形成一个稳定状态的培养。有形成一个稳定状态的培养。有封封闭式闭式和和开放式开放式2 2种。开放式连续培养又可分为种。开放式连续培养又可分为化学恒定式化学恒定式和和浊度恒浊度恒定式定式。连续培养是植物细胞培养技术中的一项重要技术,由于连续培连续培养是植物细胞培养技术中的一项重要技术,由于连续培养过程中调节细胞增殖和生长的因子如培养温度、通气、搅拌速度、养过程中调节细胞增殖和生长的因子如培养温度、通气、搅拌速度、阳光、养分以及生长调节剂都可以调节和控制,因此连续培养不仅阳光、养分以及生长调节剂都可以调节和控制,因此连
15、续培养不仅可用于植物次生产物的规模生产,也可用于对于植物细胞生长和代可用于植物次生产物的规模生产,也可用于对于植物细胞生长和代谢调节的研究。谢调节的研究。二、悬浮细胞培养体系的建立二、悬浮细胞培养体系的建立 成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件:1 1、悬浮培养物分散性良好、悬浮培养物分散性良好;细胞团较小。细胞团较小。2 2、均一性好、均一性好,细胞形状和细胞团大小大致相同。细胞形状和细胞团大小大致相同。3 3、生长迅速,细胞分裂旺盛一般在、生长迅速,细胞分裂旺盛一般在2-3d2-3d其生长量就能增加一倍其生长量就能增加一倍 。1.1.疏松愈伤组织的诱
16、导疏松愈伤组织的诱导 不同的培养基可以使愈伤组织具有不同的生长速度不同的培养基可以使愈伤组织具有不同的生长速度,结构可结构可松可紧松可紧,利用这些特性可使之分散成为单细胞或很小的细胞团。诱利用这些特性可使之分散成为单细胞或很小的细胞团。诱导出松散易碎的愈伤组织对后来建立悬浮细胞系可以起到事半功倍导出松散易碎的愈伤组织对后来建立悬浮细胞系可以起到事半功倍的效果。的效果。也可以通过多次的继代筛选而获得也可以通过多次的继代筛选而获得。一般条件下一般条件下,以幼胚诱以幼胚诱导愈伤组织为最好导愈伤组织为最好;某些情况下直接用幼胚某些情况下直接用幼胚,下胚轴下胚轴,子叶等作为外子叶等作为外植体进行悬浮培养
17、也比较容易建立悬浮细胞系。植体进行悬浮培养也比较容易建立悬浮细胞系。一般用颗粒细小、松散易碎、外观湿润、鲜艳的白色或淡黄一般用颗粒细小、松散易碎、外观湿润、鲜艳的白色或淡黄色的愈伤组织比较松散易碎、经过几次筛选、继代至稳定后、可以色的愈伤组织比较松散易碎、经过几次筛选、继代至稳定后、可以用于悬浮细胞系用于悬浮细胞系;基本培养基:基本培养基:N6,MS B5N6,MS B5 激素:激素:2,4-D 2mgL2,4-D 2mgL-1-1,附加附加6-BA,NAA 0.5mgL6-BA,NAA 0.5mgL-1-1,附加有机物:水解酪蛋白附加有机物:水解酪蛋白,L-,L-脯氨酸脯氨酸,谷氨酰胺等谷氨
18、酰胺等;培养基中蔗糖浓度较低培养基中蔗糖浓度较低(1030gL(1030gL-1-1),),有利于形成松散的愈伤有利于形成松散的愈伤组织,蔗糖浓度较高有利于形成坚硬的愈伤组织和胚状体。组织,蔗糖浓度较高有利于形成坚硬的愈伤组织和胚状体。通常情况下通常情况下,松散易碎的愈伤组织不能直接由外植体诱导获松散易碎的愈伤组织不能直接由外植体诱导获得得,而是在愈伤组织在继代过程中通过筛选获得的。而是在愈伤组织在继代过程中通过筛选获得的。悬浮培养用的培养基可以使用愈伤组织培养基悬浮培养用的培养基可以使用愈伤组织培养基,但遇到悬浮但遇到悬浮细胞变褐细胞变褐,生长缓慢或停止时生长缓慢或停止时,要重新选择培养基,
19、一般是要重新选择培养基,一般是:N6,MS,B5 N6,MS,B5适合适合单子叶植物单子叶植物细胞的悬浮培养。细胞的悬浮培养。MS,B5,LS,SLMS,B5,LS,SL等适合双子叶植物细胞的悬浮培养。等适合双子叶植物细胞的悬浮培养。悬浮细胞培养基中需要加入水解酪蛋白悬浮细胞培养基中需要加入水解酪蛋白,椰乳椰乳,脯氨酸脯氨酸等等,并注意及时更换新鲜培养基并注意及时更换新鲜培养基,一般以间隔一般以间隔3535天为适宜天为适宜;培养培养基要求过滤除菌基要求过滤除菌;操作操作:2g:2g松散易碎愈伤组织松散易碎愈伤组织-2040ml-2040ml液体培养基液体培养基-摇床摇床(120r/min,25
20、C,(120r/min,25C,黑暗或弱光黑暗或弱光)2.2.细胞悬浮培养程序细胞悬浮培养程序 取取2g2g新鲜疏松易碎的愈伤组织作为悬浮细胞培养的初始新鲜疏松易碎的愈伤组织作为悬浮细胞培养的初始材料,接入盛有材料,接入盛有202040 40 毫升液体培养基的毫升液体培养基的100100毫升三角瓶中,毫升三角瓶中,于转速于转速120 r/120 r/分钟,温度分钟,温度2525 C1C1 C C,黑暗或弱光条件下培养,黑暗或弱光条件下培养。细胞悬浮培养过程中,细胞或小细胞团的接种量,以。细胞悬浮培养过程中,细胞或小细胞团的接种量,以120 r/120 r/分钟条件下细胞或小细胞团可在培养液中浮
21、起为宜。分钟条件下细胞或小细胞团可在培养液中浮起为宜。细胞悬浮培养与植株再生过程示意图细胞悬浮培养与植株再生过程示意图 3.3.悬浮细胞的继代与选择悬浮细胞的继代与选择 悬浮细胞培养初期,可以看到原来许多较小的细胞团慢悬浮细胞培养初期,可以看到原来许多较小的细胞团慢慢变大,同时又产生一些新的小细胞团。为了得到较均一的分慢变大,同时又产生一些新的小细胞团。为了得到较均一的分散性好的悬浮细胞系,需要在每次继代时,都去掉培养液中大散性好的悬浮细胞系,需要在每次继代时,都去掉培养液中大的愈伤组织块和细胞团,保留单细胞或小细胞团,这样反复继的愈伤组织块和细胞团,保留单细胞或小细胞团,这样反复继代培养,直
22、至得到均一的悬浮细胞系为止。代培养,直至得到均一的悬浮细胞系为止。悬浮细胞的继代与选择方法悬浮细胞的继代与选择方法:方法方法1-1-将培养物摇匀,静止片刻,用吸管吸取培养基中将培养物摇匀,静止片刻,用吸管吸取培养基中部的培养物。部的培养物。方法方法2-2-通过过滤收集到小细胞团进行继代培养。通过过滤收集到小细胞团进行继代培养。另外,在更换培养基时,弃去底部的愈伤组织块和大细胞另外,在更换培养基时,弃去底部的愈伤组织块和大细胞团,只保留小细胞团在瓶内,加入新鲜培养基。团,只保留小细胞团在瓶内,加入新鲜培养基。4.4.悬浮细胞的同步化悬浮细胞的同步化 经过多次继代和筛选得到的悬浮细胞系均一性是相对
23、的,需要经过多次继代和筛选得到的悬浮细胞系均一性是相对的,需要进一步同步化培养,同步培养是指在培养体系中大多数细胞都能进一步同步化培养,同步培养是指在培养体系中大多数细胞都能同时通过细胞周期的各个阶段。同时通过细胞周期的各个阶段。衡量细胞同步化的参数:衡量细胞同步化的参数:在某一时刻处于细胞周期某一点上的细胞的百分数;在某一时刻处于细胞周期某一点上的细胞的百分数;在一个在一个短暂的具体时间内通过细胞周期中某一点的细胞的百分数;短暂的具体时间内通过细胞周期中某一点的细胞的百分数;全全部细胞通过细胞周期中某一点所需的总时间占细胞周期时间长度部细胞通过细胞周期中某一点所需的总时间占细胞周期时间长度的
24、百分数。的百分数。实现悬浮培养实现悬浮培养细胞同步化细胞同步化的方法可分为的方法可分为物理方法物理方法和和化学方法化学方法两种。物理方法主要是通过对细胞物理特性(细胞或小细胞团两种。物理方法主要是通过对细胞物理特性(细胞或小细胞团的大小)或生长环境条件(光照、温度等)的控制以实现高度的大小)或生长环境条件(光照、温度等)的控制以实现高度同步化,物理方法包括体积选择法和低温休克法。同步化,物理方法包括体积选择法和低温休克法。化学方法是使细胞遭受某种营养饥饿,或是通过加人某种生长化学方法是使细胞遭受某种营养饥饿,或是通过加人某种生长抑制剂阻断细胞分裂周期而停留于某一分裂相,从而达到细胞同抑制剂阻断
25、细胞分裂周期而停留于某一分裂相,从而达到细胞同步化的方法步化的方法。(1 1)饥饿法饥饿法 饥饿法的原理是除去细胞进行细胞分裂和生长所必需的营饥饿法的原理是除去细胞进行细胞分裂和生长所必需的营养成分或激素,使细胞停滞在细胞的分裂间期(养成分或激素,使细胞停滞在细胞的分裂间期(G G1 1期或期或G G0 0期),经期),经过一段时间的饥饿之后,重新补给除去的必须生长物质,诱导恢过一段时间的饥饿之后,重新补给除去的必须生长物质,诱导恢复静止细胞的同步分裂和生长。复静止细胞的同步分裂和生长。(2 2)抑制法)抑制法 通过使用通过使用DNADNA合成抑制剂如合成抑制剂如 5 5一氨基尿嘧啶、氟脱氧尿
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- 细胞培养 次生 代谢物 生产
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