生物大分子分离纯化技术.ppt
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1、第二章第二章生物大分子分离纯化技术生物大分子分离纯化技术12.4.生物大分子的色谱分离纯化技术22.4.1 高效毛细管电泳高效毛细管电泳 高高效效毛毛细细管管电电泳泳(High-performance Capillary Electrophoresis,HPCE)是是荷荷电电粒粒子子在在直直流流高高压压的的作作用用下下,在在毛毛细细管管中中迁迁移移,从从而而进进行行高高效效、快快速速分分离离的的一一种种电电泳泳新新技技术术。其其分分离离是是基基于于带带电电离离子子在在电电场场中中的的不不同同的的电电泳泳淌淌度度。它它的的基基本本原原理理与与常常规规凝凝胶胶电电泳泳或或自自由由电电泳泳并并无无本
2、本质质的的差差别别。所所以以,HPCE可可以以看看成成是是一一种种仪仪器器化化程程度度比比较较高高的的电电泳泳方方式。式。3由由于于毛毛细细管管具具有有良良好好的的散散热热性性能能,从从而而可可以以在在毛毛细细管管两两端端加加上上高高达达30000 V 的的高高压压、分分离离可可以以在在很很短短时时间间内内完完成成,分分离离效效率率非非常常高高。这这种种方方法法所所需需样样品品体体积积只只有有 L-nL级级。所所以以,HPEC法法的的特特点点为为:高高效效、快快速速、微微量量、易易于于实实现现自自动动化化,而而且且溶溶剂剂消耗少、环境污染小等等。消耗少、环境污染小等等。4仪器仪器 HPCEHP
3、CE仪仪器器的的基基本本组组成成如如图图所所示示,它它由由毛毛细细管管,带带电电极极的的容容器器,高高压压直直流流电电源源,进进样样系系统统,检检测测器器及及数数据据采采集集和和记记录录系系统统组组成成。比比较较先先进进的的HPCEHPCE仪仪器器还还配配有有毛毛细细管管恒恒温温设设备备,自自动动采采样样器器,微微制制备备组组分分收收集器和基于计算机的自动化及数据评价系统。集器和基于计算机的自动化及数据评价系统。56 1毛细管毛细管 HPCE在在 毛毛 细细 管管 中中 进进 行行,管管 内内 径径 一一 般般 在在25100 m之之间间,外外径径在在100400 m之之间间长长度度为为0.1
4、1m。除除了了石石英英毛毛细细管管外外,玻玻璃璃、聚聚四四氟氟乙乙烯烯(PTPE)及聚氟乙烯及聚氟乙烯-丙烯毛细管也有使用。丙烯毛细管也有使用。7 2 2进样系统进样系统 为为了了保保证证HPCEHPCE分分离离的的高高效效性性,进进样样系系统统应应尽尽量量把把nL-pLnL-pL级级的的样样品品以以最最短短的的样样品品区区带带引引入入到到毛毛细细管管中。中。一般可采用电动法或流体力学法。一般可采用电动法或流体力学法。8 3高压直流电源高压直流电源 高高压压电电源源需需提提供供高高达达30 kV的的直直流流电电压压。检检测测器器位位于于毛毛细细管管的的接接地地端端,电电流流在在3300 A之之
5、间间。电电源源应应能能以以恒恒电电压压或或恒恒电电流流(ITP)或或恒恒功功率率的的方方式式工工作作,其其稳稳定定件件应应达达到到设设置置值值的的 0.1%。另另外外,电电源源的的正正负负极极应应可可以以切切换换,以以适适应应带带不不同同电电荷荷的的样样品的分离。品的分离。9 4 4检测检测 HPECHPEC这种方法的灵敏度及高效性都依赖于检测这种方法的灵敏度及高效性都依赖于检测器的高灵敏度,实际已经采用的检测器类型有多种。器的高灵敏度,实际已经采用的检测器类型有多种。10HPEC中的主要检测技术中的主要检测技术检测原理检测原理 最低检出浓度最低检出浓度(mol/L)最低检出量最低检出量 适用
6、范围适用范围紫外可见吸收法紫外可见吸收法 10-610-4 10-1510-13 通用通用/特殊情况特殊情况基于一般光源的荧光法基于一般光源的荧光法 10-810-5 10-1810-13 特殊情况特殊情况基于激光的荧光法基于激光的荧光法 10-1210-9 10-2110-18 特殊情况特殊情况热光吸收法热光吸收法 10-810-5 10-1710-14 通用通用/特殊情况特殊情况折射率法折射率法 10-710-5 10-1610-14 通用通用电导法电导法 10-810-6 10-1910-17 特殊情况特殊情况安培法安培法 10-810-6 10-1910-17 特殊情况特殊情况质谱法质
7、谱法 10-910-5 10-1710-15 通用通用放射测定法放射测定法 10-910-7 10-1910-17 特殊情况特殊情况11分离模式分离模式 HPCE的的操操作作模模式式有有多多种种,如如毛毛细细管管区区带带电电泳泳(Capillary Zone Electrophoresis,CZE);毛毛细细管管 等等 速速 电电 泳泳(Capillary Isotachophoresis,CITP),毛毛 细细 管管 胶胶 束束 电电 动动 色色 谱谱(Capillary Micellar Electrokinetic Chromatography,CEKC);毛毛 细细 管管 凝凝 胶胶
8、电电 泳泳(Capillary Gel Electrophoresis,CGE)和和毛毛细细管管等等电电聚聚焦焦法法(Capillary Isoelectric Focusing,CIEF)等。等。12 CZECZE是是基基于于溶溶质质在在自自由由溶溶液液中中淌淌度度差差异异的的电电泳泳分分离离方方法法,是是目目前前应应用用最最广广泛泛的的一一种种,如如氨氨基基酸酸、多多肽肽及及无无机机离离子子的的分分析析,手手性性对对映映体体分分离离,蛋白质纯度鉴定及构型研究等。蛋白质纯度鉴定及构型研究等。13 CGE主主要要在在生生物物学学上上用用于于大大分分子子的的分分离离分分析析,如如蛋蛋白白质质和和
9、核核酸酸。它它是是基基于于分分子子的的尺尺寸寸,让让样样品品在在合合适适的的起起分分子子筛筛作作用用的的聚聚合合物物网网孔孔内内进进行行电电泳泳分分离。离。CGE可用于可用于DNA序列分析,蛋白质分析。序列分析,蛋白质分析。14pBR332 DNA的的MSPI酶解片段混合物的酶解片段混合物的CGE分离分离(峰(bP):1,26;2,34;3,67;4,76;5,90;6,110;7,123;8、9,147,10,11,160;12,180;13,190;14,201;15,2I7;16,238;17,242。缓冲液:TEB。进样:3s,30 mW。TEB组成:89 mmol/L Tris,89
10、mmol/L 硼酸盐及2 mmol/L EDTA)。200V/cm,毛细管有效长度:7cm,EB的浓度为1g/ml15标准蛋白质的分离162.4.2 2.4.2 液相色谱法液相色谱法 液液相相色色谱谱是是目目前前对对生生物物大大分分子子的的分分离离纯纯化化能能力力最最强强、效效率率最最高高、使使用用最最广广泛泛的的手手段段之之一一。液液相相色色谱谱大大都都在在室室温温下下操操作作,所所用用流流动动相相可可以以用用与与生生理理液液相相近近的的缓缓冲冲水水溶溶液液。所所用用固固定定相相的的表表面面经经过过化化学学修修饰饰和和覆覆盖盖,为为生生物物大大分分子子的的分分离离分分析析提提供供了了温温和和
11、的的条条件件,有有利利于于保保持持生生物物大大分分子子的的构构象象和和活活性。性。17 在在生生物物大大分分子子分分离离分分析析及及纯纯化化中中最最常常用用的的色色谱谱方方法法是是空空间间排排阻阻色色谱谱法法、离离子子交交换换色色谱谱法法、反反相相色色谱谱法法、疏疏水水作作用用色色谱谱法法、亲亲和和色色谱谱法法、羟羟基基磷磷灰灰石石(用用于于单单链链和和双双链链DNA的的纯纯化化和和鉴鉴定定)及及液液液液分配色谱法。分配色谱法。18核酸的色谱分离法核酸的色谱分离法19酶及蛋白质的各种分离纯化方法的比较酶及蛋白质的各种分离纯化方法的比较201 排阻色谱 排排阻阻色色谱谱(Size Exclusi
12、on Chromatography,SEC)也也被被称称之之为为凝凝胶胶过过滤滤色色谱谱是是20世世纪纪60年年代代发发展展起起来来的一种特别适合于生物大分子分离和纯化的技术。的一种特别适合于生物大分子分离和纯化的技术。21基本原理基本原理 排排阻阻色色谱谱是是依依据据分分离离样样品品物物质质分分子子大大小小而而进进行行分分离离的的一一种种方方法法,其其固固定定相相由由一一种种惰惰性性的的凝凝胶胶颗颗粒粒构构成成,颗颗粒粒内内部部有有许许多多网网孔孔。颗颗粒粒和和网网孔孔的的大大小小都都可可以以人人为为地地去去控控制制和和选选择择。在在分分离离过过程程中中,比比网网孔孔大大的的分分子子不不能能
13、进进入入网网孔孔的的内内部部,它它们们只只限限于于在在凝凝胶胶颗颗粒粒之之间间的的流流动动相相空空间间里里向向下下流流动动,其其流流程程短短流流动动速速度度快快,而而比比网网孔孔小小的的分分子子能能扩扩散散到到网网孔孔的的内内部部,因因而而向向下下移移动动时时所所经经历历的的流流程程长长,下下行行速速度度慢慢。最最终终所所产产生生的的结结果果是是:分分子子越越大大移移动动的的越越快快,从从而而达达到大小不同分子间的分离。到大小不同分子间的分离。2223凝胶色谱的物理特性凝胶色谱的物理特性 1凝胶颗粒的大小和形状凝胶颗粒的大小和形状 层层析析用用凝凝胶胶的的形形状状均均为为球球形形,内内部部具具
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