L_谷氨酰胺产生菌的选育和代谢流量分析.pdf
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1、的提取工艺条件下测得核桃仁内隔膜中总黄酮含量为 6.430%。3.2 该方法较简单、快速、稳定,并且实验结果为核桃仁内隔膜的综合利用提供了实验依据。因此,可作为测定核桃仁内隔膜总黄酮含量的一种方法。核桃仁内隔膜中黄酮类物质含量丰富,具有较大的开发利用价值。参考文献:1 陈勤,李磊珂,吴耀.核桃仁的成分与药理研究进展 J.安徽大学学报:自然科学版,2005,29(1):86-89.2 谢宗万.全国中草药汇编(上册)M.3 版.北京:人民卫生出版社,1996:667-668.3 买合布白#阿不都热依木,艾克白尔,库尔班尼莎,等.心草中总黄酮含量的测定及其提取工艺研究 J.生物技术,2007,17(
2、4):67-69.4 郑春英,李宏涛,陆欣媛,等.五味子叶中总黄酮最佳提取工艺的研究 J.食品科学,2007,28(5):139-141.5 刘森.中草药成分提取分离与制剂加工新技术新工艺新标准实用手册M.北京:中国教育出版社,2004:69-184.L-谷氨酰胺产生菌的选育和代谢流量分析刘春辉,张伟国*(江南大学 工业生物技术教育部重点实验室,江苏 无锡 214122)摘要:目的:建立并完善嗜乙酰乙酸棒杆菌 YL012 及其突变株 LCHA0082 合成 L-谷氨酰胺的中心代谢网络。方法:分别测定了它们在特定培养时段(48h 50h)L-谷氨酰胺等代谢物的胞外浓度,由此计算这一时段这些代谢物
3、在发酵液中积累(或消耗)的速率,分别作出这两株菌在拟稳态下的代谢流量分布图,进而研究诱变育种过程中不同诱变标记对代谢网络中 L-谷氨酰胺合成流量分布的影响。结果:育种操作使流量分配朝着有利于 L-谷氨酰胺合成的方向改变,流入谷氨酸节点的流量由291198mmol P L#h上升到 44.854mmolP L#h,提高到原来的 1.5 倍左右,合成 L-谷氨酰胺的流量由 18.138mmolP L#h 上升 至311065mmol P L#h,效果明显。结论:从代谢流量分析角度上,证明诱变育种对代谢流量的改变起到明显的作用,代谢流量分析也为新的设计育种提供了思路。关键词:嗜乙酰乙酸棒杆菌;L-谷
4、氨酰胺;诱变育种;发酵;代谢流分析中图分类号:TQ922+.9 文献标识码:A 文章编号:1004-311X(2009)04-0063-05Breeding of L-Glutamine Producer and Its Metabolic Flux AnalysisLIU Chun-hui,ZHANG Wei-guo*(Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)Abstract:Objective:Inthis paper,
5、the center metabolic networks of Corynebacterium acetoacidophilum YL012 and its mutant LCHA0082were es-tablished and modified.Method:The concentrations of extra-cellular metaboliteswere determined under sub-steady-state(48 h-50 h)in thebatch culture.The metabolic flux distributionmaps of the two str
6、ains were obtained and compared after the accumulation(or consumption)rates ofthese metabolites were measured in the broth inthe specific time.Result:These results indicate that the breeding process skew the metabolic fluxtowards the formation of L-glutamine obviously,The flow to node of glutamate i
7、ncreased from 29.198 mmol PL#h to 44.854mmolP L#h,about 115times of the original;The flow to L-glutamine synthesis changed from 18.138mmolP L#hto 31.065 mmol P L#h,the effect was significant.Conclu-sion:This study revealed the usefulness of breeding process towards existing productionstrains after t
8、he metabolic flux analysis as a tool.The analy-sis may play an important role in helping us to rationally re-design metabolism for further improvement of fermentation process.Key words:Corynebacterium acetoacidophilum;L-glutamine;breeding;fermentation;metabolic flux analysis收稿日期:2009-02-01;修回日期:2009
9、-02-27作者简介:刘春辉(1984-),男,东营市人,硕士生,研究方向:氨基酸菌种选育;*通讯作者:张伟国(1963-),男,博士生导师,教授,研究方向:工 业微 生 物菌 种 选 育、生物 能 源和 生 物 新材 料,Email:liuchunhui-lang 。L-谷氨酰胺(L-Glutamine)是 L-谷氨酸C-羧基酰胺化的一种氨基酸,作为 20 种构成蛋白质的基本氨基酸之一,在生物体代谢中起着举足轻重的作用,具有许多特殊的功能,被归类为条件必需氨基酸 1-3。目前国外临床上主要将它应用于治疗精神萎靡、酒精中毒及胃和十二指肠溃疡等疾病。另外它还具有增进神经机能,改善脑出血后的记忆障
10、碍,促进智力不佳儿童的智力发展,防止癫痫发作等功能,是一种极有发展前途的新药4-6。代谢流量分析(metabolic flux analysis,MFA)7代谢工程中用以指导遗传操作和代谢网络分析的基本方法。这种分析方法根据胞内主要反应的化学计量模型和胞内代谢产物的质量平衡来计算胞内的代谢流量。它的基础是拟稳态假设8假设在产物形成速率最快的阶段各种中间代谢物的胞内浓度变化速率为 0。根据质量平衡由 n 个中间代谢物即可得到 n 个关于速率的方程,通过测定胞外代谢产物的浓度,计算未知途径的流量9-11得到胞内代谢流的分布模式。本文通过NTG 诱变的方法,由出发菌株嗜乙酰乙酸棒杆菌YL012(MS
11、OR)得到其带有遗 传标记的突变株 LCHA0082(MSOR,SGR,(NH4)2SO4R,SucG,NaFR)。而后建立并比较两株菌的代谢网络,研究了遗传标记对代谢流量的影响。并根据流量分布为以后的设计代谢提供了参考。嗜乙酰乙酸棒杆菌进行谷氨酰胺发酵代谢流分析方面尚未见相关报道。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验材料嗜乙 酰 乙 酸 棒 杆 菌(Corynebacterium acetoacidophilum)YL012,本实验室保藏。1.1.2 试剂葡萄糖(食品级):蚌埠柠檬酸厂;玉米浆(工业级):无锡酶制剂厂;(NH4)2SO4(工业级):鹰潭生物化学制品厂;丙酮、甲醇(分析纯
12、),L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-精氨酸、L-甘氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-赖氨酸、L-苯丙氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸(生化试剂):中国医药集团上海化学试剂公司。1.1.3 仪器电子天平,Mettle 公司;超净工作台,苏净集团安泰公司;往复式摇床,无锡查桥轻机厂;电热恒温培养箱、电热鼓风干燥箱,上海跃进医疗器械厂;GSP-77-03 磁力搅拌器,江苏泰县姜埝无线电厂;立式圆形压力蒸汽灭菌器,上海医用核子仪器厂;TGL-16G 高速台式离心机,上海医用仪器分析厂;高效液相色谱仪 HP1100,惠普公司。1.1.4 培养基(1)完全培养基:葡萄糖 5g P L,蛋白胨 10
13、g PL,牛肉膏 10g PL,NaCl 5gP L,琼脂 25g PL,pH 7.0。(2)基本培养基:葡萄糖 20g PL,(NH4)2SO41.5g PL,KH2PO41g P L,K2HPO43g P L,MgSO4#7H2O 0.1g P L,MnSO4#4H2O 0.01g PL,FeSO4#7H2O 0.01g P L,尿素 1.5gP L,生物素 30Lg PL,硫胺素#HCl100LgP L,琼脂 20g PL,pH 7.0。(3)摇 瓶种 子培 养基:葡萄 糖 20g PL,(NH4)2SO45g PL,632009 年 19(4)生 物 技 术 KH2PO41g PL,M
14、gSO4#7H2O 0.5gP L,玉米浆3g P L,CaCO310g P L,pH7.0。(4)摇瓶发酵培养基:葡萄糖 130g PL,(NH4)2SO455g P L,KH2PO41.2,MgSO4#7H2O 0.6,MnSO4#4H2O 0.003,FeSO4#7H2O0.005,ZnSO4#7H2O 0.006,CaCO325g P L pH 7.5。基本培养基、完全培养基和种子培养基均在 0.1MPa 压力下灭菌 20min,发酵培养基在 0.07MPa 压力下灭菌 8min。1.2 方法1.2.1 L-谷氨酰胺测定:纸层析、茚三酮显色比色定量法及氨基酸自动分析仪。1.2.2 L-
15、谷氨酸测定:SBA-40 型生物传感器(山东省科学院生物研究所)。1.2.3 菌体浓度测定121.2.4 还原糖测定:菲林试剂法 13。1.2.5 有机酸测定81.2.6 氨基酸测定:氨基酸自动分析仪。2 结果与讨论2.1 L-谷氨酰胺代谢网络的相关说明分析L-谷氨酰胺的生物合成途径可知,首先,L-谷氨酰胺的合成需要碳源,碳源由葡萄糖(Glc)提供,然后葡萄糖经EMP 途径降解为 L-谷氨酰胺合成所需的前体碳单位丙酮酸(PYR);部分葡萄糖经磷酸戊糖(HMP)途径氧化以提供还原力。葡萄糖(Glc)的运输和消耗是在磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)磷酸转移酶系统(PEP-linked phosphotr
16、ansferase system,简称 PTS)催化下的集团运输14,15。Glc+PEPy PYR+G6P(1)以葡萄糖为氮源时乙醛酸支路活性很低,故可以不考虑乙醛酸途径;谷氨酰胺(GLN)的的合成:GLU+NH4+ATPy GLN(2)菌体生长过程中,铵根离子主要由谷氨酸脱氢酶固定,所以铵根例子由前体 A-酮戊二酸(A-KG)、谷氨酸(Glu)和NADPH 代替:A-KG+NH4+H2O+NADPHy GLU+NADP(3)谷氨酸(GLU)合成:在NH4+浓度极低的情况下(4)占优势,但由于摇瓶谷氨酰胺发酵 NH4+充足,所以直接按照(2)反应,不按(4)反应。A-KG+GLN+NADPH
17、y 2GLU+NADP(4)还原力NADPH 的补给:对于包括 L-谷氨酰胺在内的一般代谢产物的合成,如果胞内存在转氢酶,由于转氢酶可逆催化NAD H 和NADPH 之间氢的转移反应,可将 L-谷氨酰胺合成总反应所净得的 NADH 转化为还原力 NADPH 用以供应NADPH。如(5)所示。NADPH+NADy NADP+NADH(5)如果胞内不存在转氢酶,即便是反应过程中能够额外生成NADH,它还是无法转化为还原力 NADPH,那么就需要由额外的葡萄糖经磷酸戊糖(HMP)途径氧化以提供更多的还原力,HMP 途径总化学计量关系:G6Py 6CO2+12NADPH(6)根据以上原则建立了 L-谷
18、氨酰胺合成的代谢网络模型,如图 2A 所示2.2 L-谷氨酰胺形成阶段各菌株的胞外代谢产物浓度的测定从L-谷氨酰胺的生物合成的代谢网络分析可知,L-谷氨酰胺的碳架物质、能量及还原力主要由葡萄糖经中心代谢途径后提供。所以,本研究主要考虑了与 L-谷氨酰胺合成的中心代谢途径:EMP 途径和 TCA 循环以及 HMP 途径(主要用来提供还原力NADPH);又由氨基酸分析数据得到,L-谷氨酰胺发酵过程中同时产生了多种氨基酸,所以还要考虑包括甘氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸及赖氨酸的合成途径;同时,考虑了有机酸的合成途径,丙酮酸(PYR)是磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)转化而来的,
19、为了考察葡萄糖经 EMP 途径降解后,PEP 和 PYR 在代谢过程中的流量分配,所以考虑丙酮酸的代谢途径;乳酸和乙酸在有机酸合成网络中与丙酮酸直接相关,所以也被考查。由 YL012 及其突变株 LCHA0082 的发酵过程曲线可以看出,菌体生长在 48h 56h 生长缓慢,56h 左右细胞生长已进入非生长期,48h 50h 内 L-谷氨酰胺生成速度达到最大,可以认为 48h 50h时间内,细胞内处于拟稳态即各种代谢物的胞内积累为 0;因此,分别测定发酵进行到 48h 和50h的出发菌株及其突变株的胞外代谢产物浓度,研究它们在 L-谷氨酰胺形成阶段的代谢流分布。图 1A 出发菌株 YL012
20、的发酵过程曲线Fig.1A The fermentation course curve of strain YL012图 1B YL012 突变株的发酵过程曲线Fig.1B The fermentation course curve of mutant strain LCHA0082表 1 列出了出发菌株 YL012 及其突变株 LCHA0082 分别发酵到 48h 和 50h 发酵液中的还原糖、氨基酸和有机酸等的胞外浓度。根据表 1 所示数据,按下式计算代谢产物积累速率,结果见表 2。V=(C50h-C48h)1000 P2MW其中,V 为底物消耗速率或代谢产物积累速率,单位为mmol PL
21、#h;C48h、C50h分别为发酵进行到 48h 和 50h 时代谢产物的胞外浓度;MW 为对应代谢产物的分子量。2.3 L-谷氨酰胺形成阶段各菌株的代谢流量分配的计算设 V1、V2、V3,V14分别为图 2A 所示途径的代谢流量,64 生 物 技 术 2009年 19(4)假定L-谷氨酰胺形成阶段代谢处于拟稳态,此时各种中间代谢产物的累积速率为 0,由质量平衡得:表 1 YL012 菌株及其突变株 LCHA0082发酵到 48h 和 50h 时各代谢产物浓度Table 1 The various metabolites concentration of YL012 and its mutan
22、t strainLCHA0082 during 48h and 50h代谢物(metabolite)time(h)YL012(gP L)LCHA0082(gP L)葡萄糖(Glc)4839.00943.646(180.0)5037.01040.503谷氨酰胺(Gln)4820.69124.100(146.2)5020.98624.766酪氨酸(Tyr)486.4436.374(181.2)506.4536.388甘氨酸(Gly)486.4866.531(75.1)506.5316.541异亮氨酸(Ile)4815.23612.389(131.2)5015.30612.587缬氨酸(Val)48
23、3.0113.803(117.1)503.0913.900丙氨酸(Ala)488.9108.903(89.1)508.9218.919苯丙氨酸(Phe)4813.07513.057(165.2)5013.14713.075亮氨酸(Leu)4816.50614.746(131.2)5016.61714.887赖氨酸(Lys)4818.67116.019(146.2)5018.86216.276丙酮酸(Pyr)480.2090.052(88.1)500.2120.053脯氨酸(Pro)4812.06514.067(115.1)5012.17714.277精氨酸(Arg)488.6048.552(1
24、74.2)508.6488.617乳酸(Lac)485.9809.683(90.1)506.0409.810乙酸(Ac)480.2550.152(60.1)500.2750.188注:括号内数字表示代谢产物的分子量。Note:The moleculerweight of compounds mark in bracket.表 2 YL012 菌株及其突变株 LCHA0082发酵到 48h 和 50h 时各代谢产物的速率Table 2 AccumulatingP Consuming velocity of YL012 and its mutant strainLCHA0082 during 48
25、h and 50h代谢物(metabolite)YL012YL012*LCHA0082LC HA0082*葡萄糖(Glc)5.556100.0008.731100.000谷氨酰胺(Gln)1.00818.1382.27626.065酪氨酸(Tyr)0.0280.5040.0390.447甘氨酸(Gly)0.3155.6700.0670.767异亮氨酸(Ile)0.5329.5690.5748.639缬氨酸(Val)0.3416.1430.4144.742丙氨酸(Ala)0.0621.1160.0911.042苯丙氨酸(Phe)0.2193.9400.0540.618亮氨酸(Leu)0.4237
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