MS 模式识别 人参总皂苷.pdf
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1、陆益红,王广基,黄 青 ,阿基业,郝海平,郝 琨 中国药科大学药物代谢与动力学研究中心,南京 2 1 0 0 0 9;江苏省 药品检验所,南京 2 1 0 0 0 8 【摘要】目的:探讨 自发性高血压大鼠(S H R)和正常大鼠(WK Y)血浆代谢组差异,确证高血压模型,在 此基础上探讨人参 总皂苷 对 S H R血压及 代谢组 的影响。方 法:1 5只 l 2周龄 的雄 性 S H R和 1 5只 同龄 wK Y大 鼠经 2周适应性饲养后测量大鼠尾动脉收缩压(S B P)、舒张压(D B P),同时收集血浆应用 G C M S测定内源性代 谢物,用主成分分析(P C A)和偏最小二乘方判别分
2、析(P L S-D A)分析两组动物的代谢谱及引起高血压的生物标记 物。将 S H R随机分成 3组,人参总皂苷组:1 0 0 m g k g d;卡托普利组:1 0 0 m g k g d;S H R模型组:等量 0 5 C M C N a 及 WK Y组等量 0 5 C M C N a,连续灌胃4周,S H R模型组和人参总皂苷组继续给药至 8周后,测量大 鼠尾动脉 S B P、D B P 及血浆内源性代谢物。结果:与 WK Y组相比,S H R组的 S B P、D B P及血浆代谢组均有显著差 异,S H R组内源性代谢物中十六酸、吡喃半乳糖、十八碳二烯酸、羟基丁酸等化合物的浓度显著增高
3、。给药后,卡托普利组能显著降低 S B P(P0 0 1)和 S B P(P0 0 1);尽管人参总皂苷组对血压的作用不如卡托普利组明 显,但前者的代谢谱较后者向正常组代谢谱靠近的趋势更加明显。结论:S H R组和 WK Y组血浆代谢组有显著 差异,这将为进一步探讨高血压病相关的致病基因提供物质基础。长期应用人参治疗,能改善血浆代谢组,使 机体 的功 能趋 于正常。【关键词】自发性高血压大鼠;代谢组学;G c M s;模式识别;人参总皂苷【中图分类号】R 2 8 5 5 【文献标识码】A 【文章编号】1 6 7 2 3 6 5 1(2 0 0 7)0 6-0 4 4 3 0 5 代谢组学(Me
4、 t a b o l o m i c s或 M e t a b o n o m i c s)是 近年兴起的一门新型学科,代谢组学应用 L C M S、L C M S M S、G C M S以及 N MR等高通量、高分辨、高 灵敏度的现代仪器分析 手段,定性定量研究 生物 体体液 中(包 括血浆、尿 液、组 织液、细胞 培养 液 等)的内源性代谢 产物 即代 谢组(Me t a b o l o m e),结 合模式识别等化学信息学技术,分析生 物体 在不 同状态下(比如生理 与病理状 态、给药前后 等)的 代谢指纹 图谱的差异,获得相应 的生物标志物群(B i o m a r k e r s),
5、从而揭示生物体在特定时间、环境下 的整体功能状 态 的一 门学科。作 为一种 系统 方 法,代谢组学 已开始用 于药物毒性评价、药物筛选 及作用机理研究 ,也能在鉴别 和确证药理和疾 病模型上发挥作用。【收稿日期】2 0 0 7 0 9 0 7 f 基金项 目】国家 自然科 学基金 资助 项 目(N 0 3 0 5 7 2 2 2 8,3 0 6 3 0 0 7 6)7 Lx-苏省 自然科 学基金资助项 目(B K 2 0 0 5 o 9 8)【通讯作者】王广基:教授,博导,T e l:0 2 5 8 3 2 7 1 5 4 4,F a x:0 2 5 8 5 3 0 6 7 5 0,E m
6、a i l:g u a n i w a n g h o t m a i l c o n 天然 话均2 0 0 7 年 1 1 月第 5 卷第6 期 高血压病 是一种 整合 基 因因素 和环境 因素(钠盐、酒精过量和肥胖)的疾病,尤其是家族 聚集 性高血压患者有很强的遗传倾向 J。近年来,国 内外许多学 者利用基 因组学研究其发病机制,但 结果并不十分满意。自发性高血压大鼠(S H R)是 目前国际上公认的最接近于人类原发性高血压的 动物模型,其发病 因素有神经原性和非神经原性 两种,其 中目前较 明确 的主要有总外周阻力增加、交感神经系统 积极 参与、血浆前列腺素(P G l,)合 成减少 以
7、及血管代谢性变化所造成 的血管损害等 因素 。人参对血压具有 双 向调节作用,且对治疗 心 血管疾病、抗 缺氧、抗 衰老、促进蛋 白质 和核 酸的 合成、抑 制 肿 瘤 生 长 和 提 高 机 体 免疫 力 的作 用,但其物质基础与相关机制并不明确。本文首次应用 G C M S测定 S H R和 WK Y大 鼠 血浆样品中内源性代谢物,经 P C A和 P L S D A分析,发现两组动物代谢 组学有显著性差异,并找 出了 S H R区别于 W K Y的标志性化合物。在确证动物模 型后,又将人参总皂苷及作用靶点明确的降压药卡 C h i n JN a t Me d N o v 2 0 0 7
8、V o I 5 N o 6 4 4 3 维普资讯 http:/ 托普利用于 S H R,探讨人参总皂苷的作用机理。1 仪器与材料 1 1 仪 器 G C M S(T R A C E D S Q)(T h e r m o F i n i g a n,U S A);石英毛细管色谱柱:D B 一 5(3 0 in x 0 2 5 m m I D,0 2 5 p a n)(J&W s c i e n t i fi c,F o l s o m,C A,U S A);B E S N多通道 尾 动 脉 测 压 实 验 系 统(中 国 专 利,专 利 号:Z L 9 9 1 1 4 3 5 2 1 3,国际专
9、利主分类号:A 6 1 B 5 0 2 1)(中 国药科大学生理教研室)。1 2 药品与试剂 人参总皂苷 由吉林大学有机化学教研室提供;卡托普利(批号:C N l l 0 8,质量分数 9 9 9)由常州 制药厂提供;N 一 甲基一 (三 甲基硅烷)一 三氟乙酰胺(T M S F A)、三甲基氯硅烷、甲氧胺、硬脂酸甲酯、吡啶 及 一 水杨酸均购 自 S i g m a A l d r i c h C o ,纯度均大 于 9 8;庚烷(进 口分装)购 自上海国药集团。1 3实验 动 物 l 2 周龄的雄性 S H R和同龄 WK Y大 鼠均 由北 京维通利华实验动物 中心提供。动物饲养房 自然
10、明暗周期(1 0 h 1 4 h),室温为 2 3 2 5,动物 自由 摄食饮水,动物合格证:s C)(I(京)2 0 0 4 0 0 0 2。2 方法 2 1 S HR模 型 1 5只 1 2周龄 的雄性 S H R和 l 5只同龄 WK Y 大 鼠经 2 周适应性饲养后测量大鼠收缩压(S B P),同时收集血浆。2 2 人参治疗 1 5只 1 4周龄 的雄性 S H R随机均分 成 3组。人参总皂苷组:1 0 0 m g k g d;卡 托普利组:1 0 0 k s d ;S H R模 型组:等 量 0 5 C M C N a及 WK Y组(n:5)等量 0 5 C MC N a,连续 灌
11、 胃 4 周;另取 1 4只同龄雄性 S H R随机分成 2组每组 7 只分别为人参 总皂苷组和 S H R模型组,另取 8只 同龄雄性 WK Y大鼠作阴性对照,连续给药 8周 后,测量大鼠 s B P,同时收集血浆。2 3 收缩压(S B P)I 定 实验采用 B E S N多通道尾动脉测压 实验 系统 于实验前及给药 4周、8 周末测量大鼠清醒状态下 的尾动脉 S B P,每次测血压 3 次,取其平均值。比 较各组大鼠血压变化。4 4 4 C h i n N a t Me d N o v 2 O O 7 V o l 5 N o 6 2 4 血 浆收 集及 样 品 处理 动物经乙醚麻醉后眼眶
12、 内取血约 0 5 m L。E D T A抗凝,离心后收集血浆,一8 0保存。临用 时 精密吸取 1 0 0止 血浆于 E p p e n d o r f 管 中,加入 4 0 O 甲醇和 2 5 F g H a 一 水杨酸涡旋 1 0 m i n,冰浴 l h 舌 低温高速离心,取 2 0 0 上清液于 G c小瓶,通 N 2 挥干,残渣加入 l 5 甲氧胺 的吡啶溶液,室 温反应 1 6 h,再加 3 0 含 l 三 甲基氯硅烷 的 T M S F A,硅烷化反应 l h,加入 4 J。止 庚 烷后进行 G C MS 测定。2 5 G C M S 数据采集和样品分析 氦气作为载气,流速 l
13、 m L m i n。进样 口温 度 2 7 0 o C,隔垫吹扫流速为 2 0 m L m i n。程序升 温:起始温度 为 7 0,保持 2 m i n,然后 以 3 0 m i n的速度从 7 0升至 3 2 0 o C,保持 2 r n i n。传输 线温度为 2 5 0 o C,离子源温度 为 2 0 0 o C,电离能为 7 0 e V,采集 m z 5 0 6 5 0范围的 T I C图,采集时间 为 4 2 0 m i n。2 6 统计学分析 用 S P S S 1 0 0统计软件分析血压数据,所有资 料用均数 标准差(贾s)表示,三组间 比较用单 因素方差分析,两两 比较用
14、t检验,结 果 以 P 0 0 5有显著性 差异,P0 0 1有极显 著性差异。血浆代谢组 的数据采用 S I MC A P l】软件(U m e t t i c s,U m e li,S w e d e n)进行 P L S D A分析l l。3结果 3 1 S 皿模 型确 证 3 1 1 S H R和 WK Y大 鼠的 S B P和 D B P的 比较 由表 l 可知,S H R和 WK Y大鼠在 S B P和 D B P上有 显著的差异,S H R的平均 S B P均超过 2 0 0 m m H g,远 高于 WK Y大鼠的血压。Ta b l e 1 Ch a r a c t e r i
15、 s t i c s o f t h e 1 4-we e k-o l d W KY a n d S HR f n=1 5)P 0 O 1 WKY 3 1 2 S H R和 WK Y大鼠的代谢组 比较 图 1为 S H R和 W K Y大鼠血浆样品中代谢组学典型的G C MS 总离子流图,图谱 中包含了许多参 与细胞水平 寸墒丸然|摹 物2 0 0 7 年 1 1 月第5 卷第 6 期 维普资讯 http:/ 生化途径 的各类 内源性代 谢物的信息,利用 G C MS 所 附的 N I S T谱库,约鉴定出 8 0个化合物,这些 化合物很难用肉眼区分其在 S H R和 WK Y大 鼠上 的差异
16、,将两组大 鼠的代 谢组学数据 经 P L S D A 模型分析得 出一个满 意的模 型,仅第一个 主成 分 就可以解释 9 3 8,预测 9 1 9 数据(见 图 2)。3 0 只大 鼠的 P C积分 值集 中分 布 于椭 圆形散 点 图(9 5 的置信 区域 内)的 2个 区域,对主成分及 相 对应代谢谱峰 的进一 步分 析,找 出统计学 上有显 著差异 的变量化合 物(见 图 3),发现 S H R的 内源 性代谢物中十六 酸、吡 喃半乳糖、十八碳二烯 酸、羟基丁酸等化合物显著高于 WK Y。l 9 3 1 I M V o i n o s i t o l 1 3 l 0 L-T D,p
17、。p h “2 9 4 68 J TlJ L J一 一。?。一 JL 4 F i g 1 T y p i c a l G C MS c h r o m a t o g r a ms(T I C)o f p l a s m a s a mp l e s f r o m S H R(A)a n d WK Y(B)F i g 2 A g o o d P L S-DA mo d e l wi t h f o u r p r i n c i p a l c o mp o-n e n t s w a s c o m p u t e d b a s e d o n t h e d a t a f r o m
18、 S H R(H 0)a n d W KY(NO),wi t h t h e fi r s t c o mp o n e n t o n l y唧 I a i l l i l 9 3 8 a nd pr e di c t i ng 9 1 9 The s c o r e s p l o t s ho we d c o mpl e t e s e p-a r a t i o n o f t h e t wo g r o u ps,whi c h s ug g e s t e d the me t a bo l mni c d i e r e n c e b e t w e e n S H R(H
19、 0)a n d WK Y(N O)r a t s 寸嗣天然读物2 0 0 7 年 1 1 月 第 5 卷第 6 期 0 4 0 2 一 0 -0 2 D e c:2 0 0 6 d a t a 0 7 0 2 1 8 M 5(P L S-D A):1 1 囡 1 毫 6:;三 0 0 1 W c f 1 1 F i g 3 8 0 c 伽 1 p 0 I l n d s,p e a I s 粕 p l a s ma s a mp l e sof S HR a 耐 WK Y R ed s q u me s o n r i g h t s i d e(S HR)r e p r e s e n t
20、 h i g h l e v e ls o f the s e c o mp o u l l d s R ed s q u a r e s an l e f t s i d e(WKV)rep re-s e n t high l e v e l s of the s e c o mp o u n d s P o t e n t i a l b i o ma r k e r s we r e the r e a f t e r e l uc i da t e d a n d i d e n t i f i ed 3 2 人参 总皂苷及卡托普 利对 S H R血压及代谢 组的 影响 3 2 1 人
21、参总皂苷及卡托普利对 S H R血压的影响 由表 2可知,连续 4周给药后,卡托普利对 S H R 大 鼠的 S B P和 D B P均有显著改善,人参总皂苷对血 压的作用不明显,提示可能人参总皂苷的吸收差,导致降压作用较弱,需要 长期给药,也可能人参总 皂苷对心血管系统的作用并非通过降压实现的。Ta b l e 2 Effe c ts o f t o t a l g i ns e no s i de o n b l o o d pr e s s u r e o f S H R a f t e r 4w eek s(n=5)WKY S HR r 0 t a l G i n s e n o s
22、i d e(T G)1 0 0 C a o p fi l(C a p)1 0 0 1 3 6 1 2 2 O 1土 1 2 1 8 6土2 9 1 4 2 1 6 1 0 6土2 0 1 4 8土 1 2 1 3 4土3 9 1 1 09 3 2 2 人参 总皂苷及卡托普利对 S H R代谢 组学 的影响将人参 总皂苷组、卡托普利组与 S H R模 型组(含给药前后)大鼠的代谢组学数据经 P I S _ _ D A模型分析得到一张散点图,四组数据各 自聚集 在一定 区域,显示 S H R给药前后代谢组 出现 明显 变化,与 0 周相 比,S H R灌 胃给予 0 5 C MC N a 后 代谢
23、组也发生 了显著改变,提示 高血压可能引起 了组织器官损伤,进而导致代谓 组发生显著改变。将以上 S H R组 与 WK Y组的代谢组信息一并处理 又得到一张散点图(见 图 4),图中总体 上看,发现 S H R模型组最远离正 常对照(WK Y)组,卡托 普利 组居中,而人参皂苷组最靠近 WK Y组。人参总皂 C h in J Na t Me d No v2 o o 7 V o 1 5 No 6 44 5 维普资讯 http:/ 苷组、S H R模 型和 WK Y组连续 给药至 8周 的,人 参总皂苷组的代谢组更加趋近正常 WK Y组(见图 5),提示人参总皂苷组确有定的疗效,其作用也 许并非
24、通过直接降低血压来实现,而是使失衡的 代谢由疾病状态恢复到正常状态。H0 Hb Hk *Hg N0 4 I I _,S-I O A mo d e l t h t h r e e o r i n aO a l c 0 蝴lp 阻1 e I 1 髑 c 0 由翻 n e db a s e d 0 1 1 t h e d a t a f r o m S H R(I t O)、S t t R(0 5 C IV I C)(i-n,)、(I-i g)、C叩(1 皿 )a l l d WK Y(N O)I t w a s s h o w n t h a t I B(r i g)g r o u p s t o
25、 o d c l o s e l y t o t h e 1 1 0 1 11 11 t l C O I l-t r o l Wh Y(N O)T h e r e s u l t s u g g e s t e d t h a t I r e a t l tn e n t t h T G ma y p l I H i n t r i n s i c me t a h o l e me t o wa r d s t h a t o fn 叫锄 l c o n t r o l i mme r ge a l 1 0 7 0 6 0 3 Ml 5(P L S DA NO N4 移 N 8 卡CO C
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