细胞生物学研究方法细胞生物学.pptx
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1、一、光学显微镜技术(一)普通光学显微镜1.结构:照明系统:光源和聚光器 光学放大系统:物镜和目镜 机械装置:用于固定材料和观察方便 第1页/共90页双筒显微镜第2页/共90页单筒显微镜第3页/共90页2.原理:经物镜形成倒立实像,再经目镜进一步放大成像。第4页/共90页3.几个概念:放大(率)倍数:显微镜最后形成的物体放大像与被检物体的大小比例,即像高比物高。分辨力(resolving power):指显微镜(或人的眼睛距目标25cm处)能分辨物体最小间隔的能力。数值孔径(镜口率)(Numeric Aperture):NA=sin(/2)第5页/共90页光学显微镜的分辨力 R=0.61/N.A
2、其中为入射光线波长;N.A为镜口率 sin(/2);n=介质折射率;=镜口角(样品对物镜镜口的张角)。第6页/共90页表一、几种介质的折射率第7页/共90页4.显微镜的几个光学特点v制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.651.78,所用介质的折射率越接近玻璃的越好。v镜口角总是要小于180,所以sin(a/2)的最大值必然小于1 对于干燥物镜来说,介质为空气,镜口率一般为0.050.95;油镜头用香柏油为介质,镜口率可接近1.5。v普通光线的波长为400700nm,因此普通显微镜的最大分辨率数值不会小于0.2m,人眼的分辨力是200m,所以一般显微镜设计的最大放大倍数通常为1000倍。第8页/共
3、90页(二)相差显微镜(phase-contrast microscope,PCM)由PZernike于1932年发明,并因此获1953年诺贝尔物理奖。这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。利用物体不同结构成分之间的折射率和厚度的差别,把通过物体不同部分的光程差转变为振幅(光强度)的差别。P31在构造上,相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处:1.环形光阑(annular diaphragm)位于光源与聚光器之间,作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥,焦聚到标本上。2.相位板(annular phaseplate)在物镜中加了涂有氟化镁的相位板,可将直射光或衍射光的相位推
4、迟1/4 第9页/共90页环状光阑装在聚光镜的下方,而与聚光镜组合为一体相衬聚光镜。它是由大小不同的环形光阑装在一圆盘内,外面标有10X、20X、40 X、100X等字样,与相对应倍数的物镜配合使用。第10页/共90页原理图:第11页/共90页第12页/共90页微分干涉显微镜 Differential interference contrast microscope(DIC)当两束光通过光学系统时会发生相互干涉,如果相位相同,干涉的结果是亮度增强,反之,就会相互抵消变暗,这就是光波的干涉现象。微分干涉显微镜是以平面偏振光为光源,光线经棱镜折射后分成两束,在不同时间经过样品的相邻部位,然后经过另
5、一棱镜将这两束光汇合,从而样品中厚度上的微小差别就会转化成明暗区别,增加了样品反差,造成了标本的人为三维立体感,类似大理石上的浮雕。微分干涉显微镜适于研究活细胞中较大的细胞器,如果接上录像装置可以记录活细胞中的颗粒以及细胞器的运动。第13页/共90页(三)荧光显微镜 技术(Fluorescence microscope)1.荧光显微镜的特点:光源为紫外光,波长较短,分辨力高于普通显微镜 第14页/共90页照明方式通常为落射式,即光源通过物镜投射于样品上 有两个特殊的滤光片,激发光滤片用以滤除可见光,目镜和物镜之间的阻断滤片用于滤除紫外线,用以保护人目第15页/共90页荧光显微镜照片(微管呈绿色
6、、DNA蓝色)荧光标记:同一样品可以同时用两种以上的荧光素标记第16页/共90页(四)、激光扫描共焦显微境 第17页/共90页激光共聚焦扫描显微镜光路图第18页/共90页第19页/共90页激光扫描共焦显微镜的特点:v用激光作扫描光源,逐点、逐行、逐面快速扫描成像,能显示细胞样品的立体结构v分辨率大约是普通光学显微镜的3倍 v用途类似荧光显微镜,但能扫描不同层次,形成立体图像v扫描的激光与荧光收集共用一个物镜,物镜的焦点即扫描激光的聚焦点,也是瞬时成像的物点 第20页/共90页LCSM照片,蓝色为细胞核,绿色为微管 第21页/共90页(五)暗视野显微镜光路图聚光镜中央有挡光片,视野背景是黑的,只
7、允许被标本反射和衍射的光线进入物镜,物体边缘是亮的。可观察 4200nm的微粒子,分辨率比普通显微镜高50倍。第22页/共90页(六)倒置显微镜第23页/共90页倒置显微镜 inverse microscope 物镜与照明系统颠倒;用于观察培养的活细胞,通常具有相差或DIC物镜,有的还具有荧光装置。第24页/共90页二、电子显微镜技术(electron microscope)(一)、透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)1932年Ruska发明第25页/共90页原理:(电子显微镜与光学显微镜的成像原理基本一样)v 用电子束作光源,用电磁场作透
8、镜,电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比,也就是说电压越高波长越短.v分辨率0.2nm,放大倍数为数百万倍.v用于观察超微结构(ultrastructure),及小于0.2 m,光镜下无法看清的结构.第26页/共90页光光镜镜与与电电子子显显微微镜镜(透透射射电电镜镜)的的结结构构第27页/共90页3.制样技术:1)超薄切片技术:步骤:P36电子束穿透力很弱,超薄切片厚度仅50nm左右,用超薄切片机(ultramicrotome)制作。通常以锇酸和戊二醛固定样品,丙酮逐级脱水,环氧树脂包埋,以热膨胀或螺旋推进的方式切片,重金属(铀、铅)盐染色。第28页/共90页莱卡超薄切片机第29页/共
9、90页内质网透射电镜图第30页/共90页2)负染技术用重金属盐(如磷钨酸)染色;吸去染料干燥后,样品凹陷处铺了一层重金属盐,而凸的出地方没有染料沉积,从而出现负染效果,分辨力可达1.5nm左右。Negative Stained Archaebacteria 第31页/共90页3)冰冻蚀刻(freeze-etching):v 标本置于-100度的干冰或-196度的液氮中,进行快速冰冻。v用冷刀骤然将标本断开 v升温,冰在真空条件下迅即升华,暴露出断面结构-蚀刻 v向断面以45度角喷涂一层蒸汽铂,再以90度角喷涂一层碳,加强反差和强度。然后用次氯酸钠溶液消化样品,把碳和铂的膜剥下来,此膜即为复膜(
10、replica)。复膜显示出了标本蚀刻面的形态,在电镜下得到的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。第32页/共90页冰冻断裂与冰冻蚀刻技术第33页/共90页(二)、扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)20世纪60年代问世,用来观察标本的表面结构.第34页/共90页用一束极细的电子束扫描样品,在样品表面激发出次级电子,次级电子的多少与电子束入射角有关,也就是说与样品的表面结构有关,次级电子由探测体收集,并在那里被闪烁器转变为光信号,再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度,显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象,反映了标本的
11、表面结构。为了使标本表面发射出次级电子,标本在固定、脱水后,要喷涂上一层重金属微粒,重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。第35页/共90页第36页/共90页(三)、扫描隧道显微镜(scanning tunneling microscope,STM)v 由Binnig等1981年发明,是一种探测微观世界物质表面形貌的仪器.根据量子力学原理中的隧道效应而设计。当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时,此处电子云重叠,外加一电压(2mV2V),针尖与样品之间产生隧道效应而有电子逸出,形成隧道电流。电流强度和针尖与样品间的距离有函数关系,当探针沿物质表面按给定高度扫描时,因样品表面原子凹凸
12、不平,使探针与物质表面间的距离不断发生改变,从而引起电流不断发生改变。将电流的这种改变图像化即可显示出原子水平的凹凸形态。第37页/共90页v利用扫描隧道显微镜直接观察生物大分子,如DNA、RNA和蛋白质等分子的原子布阵,和某些生物结构,如生物膜、细胞壁等的原子排列。v分辨率很高,横向为0.10.2nm,纵向可达0.001nm v优点是三态(固态、液态和气态)物质均可进行观察,而普通电镜只能观察制作好的固体标本。第38页/共90页 第二节第二节 细胞组分的分析方法细胞组分的分析方法一、离心技术(一)、细胞破碎:(二)、差速离心(differential centrifugation)v在密度均
13、一的介质中由低速到高速逐级离心,用于分离不同大小的细胞和细胞器。v差速离心只用于分离大小悬殊的细胞,更多用于分离细胞器。通过差速离心可将细胞器初步分离 第39页/共90页速度逐渐提高,样品按大小先后沉淀 第40页/共90页(三)、密度梯度离心(density gradient centrifugation):1、速度沉降(velocity sedimentation):v用途:用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器 v特点:介质密度较低,介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度 v原理:介质密度梯度十分平缓,生物颗粒(细胞或细器)按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离 第41页/共9
14、0页2、等密度沉降(isopycnic sedimentation):v用途:用于分离密度不等的颗粒 v特点:介质密度较高,陡度大,介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度;所需要的力场通常比速率沉降法大10100倍,故往往需要高速或超速离心 v原理:细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力或足够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处,并停留在那里达到平衡,从而将不同密度的细胞或细胞器分离 第42页/共90页二、细胞化学(cytochemistry)技术细胞内大分子物质的显示方法P40v福尔根(Feulgen)反应:特异显示DNA的分布,酸水解-与希夫(Schiff)试剂反应-呈红色第
15、43页/共90页Feulgen Reaction第44页/共90页vPAS反应:显示多糖的存在 利用希夫(Schiff)试剂 糖原由D-葡萄糖的分支或直链组成,过碘酸是一种强氧化剂,能将葡萄糖中乙二醇基(CHOH-CHOH)氧化成二个游离醛基(CHO),游离醛基与Schiff s试剂反应生成紫红色产物,颜色深浅与多糖含量成正比。第45页/共90页(二)其它显示方法1.金属沉淀法:如磷酸酶分解磷酸酯底物后,反应产物最终生成CoS或PbS有色沉淀,而显示出酶活性。格莫瑞方法(P40)2.Schiff反应:醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。用于显示糖和脱氧核糖核酸(Feulgen反应)。
16、3.联苯胺反应:过氧化酶分解H202。产生新生氧,后者再将无色联苯胺氧化成联苯胺蓝,进而变成棕色化合物。4.脂溶染色法:借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色(深红色)。5.米伦反应:氮汞试剂与蛋白质上的酪氨酸残基反应,形成红色沉淀,显示蛋白质的存在。(P40)第46页/共90页三、免疫细胞化学(immunocytochemistry)特异蛋白抗原的定位与定性 v研究细胞内蛋白质分子定位的重要技术。v应用免疫学原理,利用抗体同特定抗原专一结合,对抗原进行定位测定的技术。(一)免疫荧光技术(immunofluorescent technique)P41荧光素:异硫氰酸荧光素(fluoreceinisot
17、hiocyante,FITC),为黄色、橙黄色或褐黄色结晶粉末,有两种异构体,易溶于水和酒精等溶剂。分子量为389,最大吸收光谱为490495,最大发射光谱为520530urn,呈现明亮的绿色荧光,是最常用的标记抗体的荧光素。免疫酶标技术:辣根过氧化物酶 第47页/共90页(二)免疫电镜技术 免疫胶体金技术:金胶体颗粒氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下,可聚合成一定大小的金颗粒,形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态,故称胶体金。胶体金标记,实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷,与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结
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- 细胞生物学 研究 方法
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