生物大分子识别分离和检测精.ppt
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1、生物大分子识别分离和检测第1页,本讲稿共20页生物大分子生物大分子生物大分子生物大分子:指分子量大于10,000,有复杂空间结构,具有生物活性的物质;如多肽、蛋白质、酶等。特性:特性:具有特定的生化结构(组成,序列和构象)分子量大,分子极性强 对温度、pH值、剪切力、有机溶剂等非常敏感第2页,本讲稿共20页生物大分子的识别生物大分子的识别“看清看清”生物大分子生物大分子“是谁是谁”;“看清看清”生物大分子生物大分子“是什么样子是什么样子”。第3页,本讲稿共20页 质谱测定分析质谱测定分析 一种识别生物大分子的方法一种识别生物大分子的方法 质谱测定分析法是通过测定样品中物质的质量来识别物质的类质
2、谱测定分析法是通过测定样品中物质的质量来识别物质的类别。别。传统的质谱分析方法是:传统的质谱分析方法是:首先将成团的蛋白质分子拆分成各自独立的单个分子,将其电离并使首先将成团的蛋白质分子拆分成各自独立的单个分子,将其电离并使之悬浮在真空中,然后让它们在电场作用下运动。之悬浮在真空中,然后让它们在电场作用下运动。这种方法的缺点在于生物大分子比较脆弱,在拆分和电离成团这种方法的缺点在于生物大分子比较脆弱,在拆分和电离成团的生物大分子过程中它们的结构和成分很容易被破坏。的生物大分子过程中它们的结构和成分很容易被破坏。第4页,本讲稿共20页美国科学家约翰美国科学家约翰芬恩,获芬恩,获20022002年
3、年诺贝尔化学奖诺贝尔化学奖日本科学家田中日本科学家田中耕一,获耕一,获20022002年年诺贝尔化学奖诺贝尔化学奖对成团的生物大对成团的生物大分子施加强电场分子施加强电场用软激光轰击成用软激光轰击成团的生物大分子团的生物大分子使生物大分子相互完整地分离,同时也被电离使生物大分子相互完整地分离,同时也被电离。第5页,本讲稿共20页芬恩的电喷雾质谱技术(芬恩的电喷雾质谱技术(ESIESI)原理图)原理图田中耕一的软激光解吸附质谱技术田中耕一的软激光解吸附质谱技术(RLD)原理图)原理图质谱测定方法解决了质谱测定方法解决了“看清看清”生物大分子生物大分子“是谁是谁”的问的问题题第6页,本讲稿共20页
4、电喷雾电喷雾质谱质谱法法electron spray mass spectrometry ESMSelectron spray mass spectrometry ESMS 样品溶液经很细的进样管进入电喷雾室,在强电场的作用样品溶液经很细的进样管进入电喷雾室,在强电场的作用下,样品溶液在出口处因电荷的分离和静电引力而破碎成许多下,样品溶液在出口处因电荷的分离和静电引力而破碎成许多细小的带有电荷的液滴,当液滴蒸发到某一程度,液滴表面的细小的带有电荷的液滴,当液滴蒸发到某一程度,液滴表面的库仑斥力使液滴爆炸。产生的小带电液滴继续此过程。随着液库仑斥力使液滴爆炸。产生的小带电液滴继续此过程。随着液滴
5、的水分子逐渐蒸发,就可获得自由徘徊的质子化和去质子化滴的水分子逐渐蒸发,就可获得自由徘徊的质子化和去质子化的蛋白分子。的蛋白分子。第7页,本讲稿共20页电喷雾液相色谱质谱联用仪电喷雾液相色谱质谱联用仪第8页,本讲稿共20页 样品的分子离子和裂片离子经一系列分离器和静电透镜样品的分子离子和裂片离子经一系列分离器和静电透镜进入质量分析器进行质谱分析。进入质量分析器进行质谱分析。这种电喷雾质谱法具有很高灵敏度,且电离的分子可以带这种电喷雾质谱法具有很高灵敏度,且电离的分子可以带有多电荷,这种多电荷离子的产生大大扩展了普通质谱仪能有多电荷,这种多电荷离子的产生大大扩展了普通质谱仪能分析的质量范围,使质
6、谱仪可以分析分子量为几十万质量单分析的质量范围,使质谱仪可以分析分子量为几十万质量单位的蛋白质分子。精确度达到位的蛋白质分子。精确度达到99.99%99.99%。第9页,本讲稿共20页 激光解吸附电离飞行时间质谱激光解吸附电离飞行时间质谱 Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry(MALDI-TOF MS)MALDI-TOF MSMALDI-TOF MS的原理是:当用一定强度的激光照射样品与基质形的原理是:当用一定强度的激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜,基质从激光中吸收能量,样品解
7、吸附,基质成的共结晶薄膜,基质从激光中吸收能量,样品解吸附,基质-样品之样品之间发生电荷转移使得样品分子电离,电离的样品在电场作用下加速飞间发生电荷转移使得样品分子电离,电离的样品在电场作用下加速飞过飞行管道,根据到达检测器的飞行时间不同而被检测,即测定离子过飞行管道,根据到达检测器的飞行时间不同而被检测,即测定离子的质量电荷之比(的质量电荷之比(M/ZM/Z)与离子的飞行时间成正比来检测离子。)与离子的飞行时间成正比来检测离子。MALDI-TOF-MS MALDI-TOF-MS的中心技术就是依据样品的质荷比(的中心技术就是依据样品的质荷比(m/zm/z)的)的不同来进行检测,并测得样品分子的
8、分子量。不同来进行检测,并测得样品分子的分子量。第10页,本讲稿共20页 MALDI-TOF MSMALDI-TOF MS具有灵敏度高、具有灵敏度高、准确度高、分辨率高、图谱简明、准确度高、分辨率高、图谱简明、质量范围广及速度快等特点,在操质量范围广及速度快等特点,在操作上制样简便、可微量化、大规模、作上制样简便、可微量化、大规模、并行化和高度自动化处理待检生物并行化和高度自动化处理待检生物样品,而且在测定生物大分子和合样品,而且在测定生物大分子和合成高聚物应用方面有特殊的优越性。成高聚物应用方面有特殊的优越性。近年来已成为检测和鉴定多肽、蛋近年来已成为检测和鉴定多肽、蛋白质、多糖、核苷酸、糖
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