原位分子杂交组织化学概要.ppt
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1、原位分子杂交组织化学InIn Situ Hybridization Situ Hybridization HistochemistryHistochemistry(ISHH)ISHH)一、概念 用已知碱基顺序并带有标记物的用已知碱基顺序并带有标记物的核核酸探针酸探针与组织、细胞中与组织、细胞中待测的核酸待测的核酸按碱按碱基配对的原则进行基配对的原则进行特异性结合特异性结合,形成杂,形成杂交体,然后再用与标记物对应的检测系交体,然后再用与标记物对应的检测系统,通过统,通过组织化学或免疫组织化学方法组织化学或免疫组织化学方法在核酸在核酸原有位置原有位置进行进行细胞内定位细胞内定位。二、原位杂交的基
2、本原理二、原位杂交的基本原理三、原位杂交组织化学技术的应用 1.1.1.1.细胞特异性细胞特异性细胞特异性细胞特异性mRNAmRNAmRNAmRNA转录的定位;转录的定位;转录的定位;转录的定位;2.2.2.2.癌癌癌癌基基基基因因因因、抑抑抑抑癌癌癌癌基基基基因因因因及及及及各各各各种种种种功功功功能能能能基基基基因因因因在在在在转转转转录录录录水水水水平的表达平的表达平的表达平的表达 及其变化的研究;及其变化的研究;及其变化的研究;及其变化的研究;3.3.3.3.病原微生物检测;病原微生物检测;病原微生物检测;病原微生物检测;4 4 4 4.基因在染色体上的定位;基因在染色体上的定位;基因
3、在染色体上的定位;基因在染色体上的定位;5.5.5.5.检测染色体的变化;检测染色体的变化;检测染色体的变化;检测染色体的变化;6 6 6 6.分裂间期细胞遗传学的研究。分裂间期细胞遗传学的研究。分裂间期细胞遗传学的研究。分裂间期细胞遗传学的研究。四、核酸探针的种类根据探针的根据探针的根据探针的根据探针的核酸性质核酸性质核酸性质核酸性质不同不同不同不同 DNADNADNADNA探针、探针、探针、探针、RNARNARNARNA探针、探针、探针、探针、cDNAcDNAcDNAcDNA探针、探针、探针、探针、cRNAcRNAcRNAcRNA探针、探针、探针、探针、寡核苷酸探针寡核苷酸探针寡核苷酸探针
4、寡核苷酸探针根据探针的根据探针的根据探针的根据探针的标记方法标记方法标记方法标记方法不同不同不同不同 放射性探针:放射性探针:放射性探针:放射性探针:32323232P P P P、3 3 3 3H H H H、35353535S S S S 非放射性探针:生物素标记非放射性探针:生物素标记非放射性探针:生物素标记非放射性探针:生物素标记 地高辛标记地高辛标记地高辛标记地高辛标记 荧光标记荧光标记荧光标记荧光标记 DNA DNA探针探针1.1.1.1.克隆在质粒载体中,可以无限增殖,制备简便。克隆在质粒载体中,可以无限增殖,制备简便。克隆在质粒载体中,可以无限增殖,制备简便。克隆在质粒载体中,
5、可以无限增殖,制备简便。2.2.2.2.不易降解。不易降解。不易降解。不易降解。3.3.3.3.标记的方法较成熟多样(切口平移等)标记的方法较成熟多样(切口平移等)标记的方法较成熟多样(切口平移等)标记的方法较成熟多样(切口平移等)cDNA cDNA 探针探针1.1.1.1.互补于互补于互补于互补于 mRNA mRNA mRNA mRNA 的的的的DNA DNA DNA DNA 分子。分子。分子。分子。2.2.2.2.逆转录合成,不含内含子序列,适宜基因表达的检测。单链比双逆转录合成,不含内含子序列,适宜基因表达的检测。单链比双逆转录合成,不含内含子序列,适宜基因表达的检测。单链比双逆转录合成
6、,不含内含子序列,适宜基因表达的检测。单链比双链灵敏度高,且不需变性,使能与靶链灵敏度高,且不需变性,使能与靶链灵敏度高,且不需变性,使能与靶链灵敏度高,且不需变性,使能与靶mRNAmRNAmRNAmRNA结合的探针浓度提高。结合的探针浓度提高。结合的探针浓度提高。结合的探针浓度提高。cRNAcRNA探针探针1.1.1.1.单链分子,杂交反应效率高。单链分子,杂交反应效率高。单链分子,杂交反应效率高。单链分子,杂交反应效率高。2.2.2.2.可控制转录方向,得到同义可控制转录方向,得到同义可控制转录方向,得到同义可控制转录方向,得到同义RNA RNA RNA RNA 探针(与探针(与探针(与探
7、针(与mRNAmRNAmRNAmRNA同序列),或反义同序列),或反义同序列),或反义同序列),或反义RNA RNA RNA RNA 探针(探针(探针(探针(cRNAcRNAcRNAcRNA,与与与与mRNAmRNAmRNAmRNA 互补)。互补)。互补)。互补)。3.3.3.3.可检测可检测可检测可检测DNA DNA DNA DNA 和和和和mRNAmRNAmRNAmRNA,还可观察基因的转录状况。还可观察基因的转录状况。还可观察基因的转录状况。还可观察基因的转录状况。4.4.4.4.易于降解,标记方法复杂。易于降解,标记方法复杂。易于降解,标记方法复杂。易于降解,标记方法复杂。寡核苷酸探针
8、寡核苷酸探针寡核苷酸探针寡核苷酸探针1.1.1.1.链短、分子量小、序列复杂度低,杂交时间比克隆探针短。链短、分子量小、序列复杂度低,杂交时间比克隆探针短。链短、分子量小、序列复杂度低,杂交时间比克隆探针短。链短、分子量小、序列复杂度低,杂交时间比克隆探针短。2.2.2.2.可识别靶序列中一个碱基的变化,故成套探针用于碱基点突变的检测。可识别靶序列中一个碱基的变化,故成套探针用于碱基点突变的检测。可识别靶序列中一个碱基的变化,故成套探针用于碱基点突变的检测。可识别靶序列中一个碱基的变化,故成套探针用于碱基点突变的检测。3.3.3.3.一次可大量合成,价格低廉,易于标记。一次可大量合成,价格低廉
9、,易于标记。一次可大量合成,价格低廉,易于标记。一次可大量合成,价格低廉,易于标记。4.4.4.4.缺点:与克隆探针比较,特异性差,杂交信号弱。缺点:与克隆探针比较,特异性差,杂交信号弱。缺点:与克隆探针比较,特异性差,杂交信号弱。缺点:与克隆探针比较,特异性差,杂交信号弱。设计筛选寡核苷酸探针的原则设计筛选寡核苷酸探针的原则1.1.1.1.长长长长30-50bp30-50bp30-50bp30-50bp,长探针则杂交时间长,短则特异长探针则杂交时间长,短则特异长探针则杂交时间长,短则特异长探针则杂交时间长,短则特异性差。性差。性差。性差。2.2.2.2.碱基成分:碱基成分:碱基成分:碱基成分
10、:G G G GC C C C含量为含量为含量为含量为 40%40%40%40%-60%-60%-60%-60%。3.3.3.3.探针分子内不能有互补区。探针分子内不能有互补区。探针分子内不能有互补区。探针分子内不能有互补区。探针种类探针种类探针种类探针种类 优点优点优点优点 缺点缺点缺点缺点 cDNAcDNAcDNAcDNA 1.1.1.1.制制制制备简单备简单备简单备简单 2.2.2.2.放射比活性高放射比活性高放射比活性高放射比活性高 3.3.3.3.信号特异性信号特异性信号特异性信号特异性强强强强 4.4.4.4.杂交体较稳定杂交体较稳定杂交体较稳定杂交体较稳定 1.1.1.1.变变变
11、变性后才能使用性后才能使用性后才能使用性后才能使用 2.2.2.2.要基因克隆要基因克隆要基因克隆要基因克隆 3.3.3.3.组织组织组织组织穿透力差穿透力差穿透力差穿透力差 4.4.4.4.易于退火易于退火易于退火易于退火 cRNAcRNAcRNAcRNA 1.1.1.1.信号特异性信号特异性信号特异性信号特异性强强强强 2.2.2.2.不需不需不需不需变变变变性性性性 3.3.3.3.杂杂杂杂交后可用交后可用交后可用交后可用RNaseRNaseRNaseRNase除去除去除去除去 未未未未杂杂杂杂交的探交的探交的探交的探针针针针 4.4.4.4.杂杂杂杂交体非常交体非常交体非常交体非常稳稳
12、稳稳定定定定 5.5.5.5.不会退火不会退火不会退火不会退火 1.1.1.1.易被易被易被易被RnaseRnaseRnaseRnase降解降解降解降解 2.2.2.2.易吸附于器皿上易吸附于器皿上易吸附于器皿上易吸附于器皿上 3.3.3.3.组织组织组织组织穿透力差穿透力差穿透力差穿透力差 4.4.4.4.需做亚克隆需做亚克隆需做亚克隆需做亚克隆寡聚核苷酸寡聚核苷酸寡聚核苷酸寡聚核苷酸 1.1.1.1.易制备易制备易制备易制备 2.2.2.2.使用方便使用方便使用方便使用方便 3.3.3.3.组织组织组织组织穿透力穿透力穿透力穿透力强强强强 4.4.4.4.不需做克隆不需做克隆不需做克隆不需
13、做克隆 5.5.5.5.不会退火不会退火不会退火不会退火 6 6 6 6.只要知道氨基酸顺序便只要知道氨基酸顺序便只要知道氨基酸顺序便只要知道氨基酸顺序便 可制备探针可制备探针可制备探针可制备探针 1.1.1.1.需核酸合成仪需核酸合成仪需核酸合成仪需核酸合成仪 2.2.2.2.需明确需明确需明确需明确mRNAmRNAmRNAmRNA顺顺顺顺序序序序 3.3.3.3.单单单单碱基碱基碱基碱基错误错误错误错误将影响将影响将影响将影响杂杂杂杂交交交交 4.4.4.4.杂交体不太稳定杂交体不太稳定杂交体不太稳定杂交体不太稳定 五五.探针标记探针标记 探针的标记物分为放射性标记和非放射探针的标记物分为
14、放射性标记和非放射性标记两大类:性标记两大类:放射性标记物一般为放射性标记物一般为125125I I、3535S S或或3232P P;非放射性标记有生物素或地高辛的间接非放射性标记有生物素或地高辛的间接标记,也有标记,也有FITCFITC或者罗丹明对探针分子或者罗丹明对探针分子的直接标记。的直接标记。探针标记方法比较探针标记方法比较1.1.敏感性:放射性探针地高辛探针生物素探敏感性:放射性探针地高辛探针生物素探敏感性:放射性探针地高辛探针生物素探敏感性:放射性探针地高辛探针生物素探针针针针2.2.对人危害性:放射性探针、生物素探针对人危害性:放射性探针、生物素探针对人危害性:放射性探针、生物
15、素探针对人危害性:放射性探针、生物素探针3.3.放射性探针受半衰期限制,不可长期保存。放射性探针受半衰期限制,不可长期保存。放射性探针受半衰期限制,不可长期保存。放射性探针受半衰期限制,不可长期保存。4.4.生物素探针受内源性生物素影响,可致假阳性;生物素探针受内源性生物素影响,可致假阳性;生物素探针受内源性生物素影响,可致假阳性;生物素探针受内源性生物素影响,可致假阳性;地高辛探针则显色复杂。地高辛探针则显色复杂。地高辛探针则显色复杂。地高辛探针则显色复杂。探针标记方法探针标记方法 探针标记方法很多,大致分为:探针标记方法很多,大致分为:探针标记方法很多,大致分为:探针标记方法很多,大致分为
16、:引入法和化学修饰法。引入法和化学修饰法。引入法和化学修饰法。引入法和化学修饰法。*引入法:运用标记好的核苷酸来合成探针;引入法:运用标记好的核苷酸来合成探针;引入法:运用标记好的核苷酸来合成探针;引入法:运用标记好的核苷酸来合成探针;*化学修饰法:采用化学方法将标记物掺入已化学修饰法:采用化学方法将标记物掺入已化学修饰法:采用化学方法将标记物掺入已化学修饰法:采用化学方法将标记物掺入已合成的探针分子中去,或改变探针原有的结合成的探针分子中去,或改变探针原有的结合成的探针分子中去,或改变探针原有的结合成的探针分子中去,或改变探针原有的结构,使之产生特定的化学基团。构,使之产生特定的化学基团。构
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