单核苷酸多态性检测技术优秀PPT.ppt
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1、单核苷酸多态性检测技单核苷酸多态性检测技术术第1页,本讲稿共32页内容简介内容简介1SNP 概概 念念2SNP 特特 点点3SNP 检 测 技技 术4实 验第2页,本讲稿共32页SNP 的概念的概念 n n单核苷酸多态性单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP),指由于单个核苷酸碱基的改变而导致的核酸序列的多态性。在不同个体的同一条染色体或同一位点的核苷酸序列中,绝大多数核苷酸序列一致而只有一个碱基不同的现象,即SNP。n n它包括单碱基的转换,颠换、插入及缺失等形式第3页,本讲稿共32页SNP在基因组内的形式在基因组内的形式:n n一是遍布于基因组
2、的大量单碱基变异;n n二是分布在基因编码区(coding region),称其为cSNP,属功能性突变。SNP在单个基因或整个基因组的分布是不均匀的:(1)非转录序列要多于转录序列(2)在转录区非同义突变的频率,比其他方式突变的频率低得多。第4页,本讲稿共32页SNP 的特点的特点 n n在遗传学分析中,SNP 作为一类遗传标记得以广泛应用,主要源于这几个特点:(1)密度高SNP在人类基因组的平均密度估计为 11000 bp,在整个基因组的分布达 3106个,遗传距离为 23cM,密度比微卫星标记更高,可以在任何一个待研究基因的内部或附近提供一系列标记。(2)富有代表性某些位于基因内部的SN
3、P 有可能直接影响蛋白质结构或表达水平,因此,它们可能代表疾病遗传机理中的某些作用因素。第5页,本讲稿共32页SNP 的特点的特点(3)遗传稳定性 与微卫星等重复序列多态性标记相比,SNP 具有更高的遗传稳定性。(4)易实现分析的自动化SNP标记在人群中只有两种等位型(allele)。这样在检测时只需一个“+-”或“全无”的方式,而无须象检测限制性片段长度多态性,微卫星那样对片段的长度作出测量,这使得基于SNP的检测分析方法易实现自动化。第6页,本讲稿共32页一、一、SNPs经典检测方法经典检测方法n n一大类是以凝胶电泳为基础的传统经典的检测方法,如:1.限制性片段长度多态性法 PCR-RF
4、LP;2.单链构象多态性法 PCR-SSCP;3.变性梯度凝胶电泳(dena t ur i ng gradient gel eletrophoresi s DGGE);4.等位基因特异性 PCR(allele specific PCR,ASPCR)等等第7页,本讲稿共32页PCR-RFLP方法方法 原理:原理:利用限制性内切酶的酶切位点的特异性,用两种或两种以上的限制性内切酶作用于同一DNA片断,如果存在SNP位点,酶切片断的长度和数量则会出现差异,根据电泳的结果就可以判断是否SNP位点。特点:特点:该技术应用的前提是SNP的位点必须含有该限制内切酶的识别位点,它是SNP筛查中最经典的方法之一
5、.第8页,本讲稿共32页PCR-RFLP原理图原理图第9页,本讲稿共32页单链构象多态性单链构象多态性(SSCP)原理:原理:单链单链DNA DNA 在中性条件下会形成二级结构,不同在中性条件下会形成二级结构,不同的的二级结构在电泳中会出现不同的迁移率。这种二级结构依赖二级结构在电泳中会出现不同的迁移率。这种二级结构依赖于碱基的组成,单个碱基的改变也会影响其构象,最终会于碱基的组成,单个碱基的改变也会影响其构象,最终会导导致在凝胶上迁移速度的改变。致在凝胶上迁移速度的改变。在非变性聚丙烯酰胺凝胶上,短的单链在非变性聚丙烯酰胺凝胶上,短的单链 DNA DNA 和和RNA RNA 分分子依其单碱基
6、序列的不同而形成不同的构象,这样在凝子依其单碱基序列的不同而形成不同的构象,这样在凝胶上胶上的迁移速率不同,出现不同的条带,检测的迁移速率不同,出现不同的条带,检测SNPSNP。特点:特点:特点:特点:由于该方法简单快速,因而被广泛运用于未知基因由于该方法简单快速,因而被广泛运用于未知基因突变的检测。这种方法的弊端在于不能确定突变类型和突变的检测。这种方法的弊端在于不能确定突变类型和具体位置。具体位置。第10页,本讲稿共32页变性梯度凝胶电泳(变性梯度凝胶电泳(DGGE)n n原理:原理:原理:原理:是利用长度相同的双链 DNA片段解链温度不同的原理,通过梯度变性胶将 DNA片段分开的电泳技术
7、。电泳开始时,DNA 在胶中的迁移速率仅与分子大小有关,而一旦DNA 泳动到某一点时,即到达该DNA 变性浓度位置时,使得DNA 双链开始分开,从而大大降低了迁移速率。当迁移阻力与电场力平衡时,DNA 片段在凝胶中基本停止迁移。由于不同的DNA 片段的碱基组成有差异,使得其变性条件产生差异,从而在凝胶上形成不同的条带。第11页,本讲稿共32页第12页,本讲稿共32页等位基因特异等位基因特异 PCR(AS-PCR)原理:原理:根据 SNP位点设计特异引物,其中一条链(特异链)的3末端与 SNP位点的碱基互补(或相同),另一条链(普通链)按常规方法进行设计,因此,AS-PCR技术是一种基于SNP的
8、PCR标记。因为特异引物在一种基因型中有扩增产物,在另一种基因型中没有扩增产物,用凝胶电泳就能够很容易地分辨出扩增产物的有无,从而确定基因型的 SNP。第13页,本讲稿共32页第14页,本讲稿共32页SNPs高通量的检测方法高通量的检测方法 另一大类检测方法是近些年来发展起来的,高通量、自动化程度较高的检测 SNPs的方法,较为常用的有:1.DNA测序法;2.DNA芯片检测;3.飞行质谱仪(MALDI-TOFMS)检测;4.变性高效液相色谱(DH PLC)法等等第15页,本讲稿共32页DNA测序法测序法n n直接测序是最容易实施的SNP检测方法。原理原理:通过对不同个体同一基因或基因片段进行测
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