细胞融合概述PPT课件.ppt
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1、细细胞融合概述胞融合概述1.细细胞融合(胞融合(cell fusion),又称体细胞杂交(somatic hybridiazation),是指两个或更多个相同或不同细胞通过膜 融合形成单个细胞的过程。一、一、细细胞融合的定胞融合的定义义2.uMuller于1838年观察到脊椎动的肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞。uVirchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。uLuginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在。uLange于1875年第一个观察到脊椎动物(蛙类)的血液细胞发生融合的过程。uCienkawski(1876)、B
2、uck(1877)、Geddes(1880)在无脊椎动中发现了细胞合并现象。u1958年日本学者冈田(Okada)发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。u1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇(PEG)化学融合法。u1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。u20世纪80年代出现了电融合技术。二、二、细细胞融合研究胞融合研究进进展展3.生物种生物种生物种生物种类类类类细细细细胞来源胞来源胞来源胞来源成功年代成功年代成功年代成功年代烟草两个种烟草两个种间间苷苷蓝蓝青菜青菜大豆大豆马马唐草唐草矮矮牵牵牛牛龙龙面花
3、面花大麦大麦花生花生大麦大麦大豆大豆小麦小麦矮矮牵牵牛牛油菜油菜大豆大豆玉米玉米大豆大豆大豆大豆野豌豆野豌豆大麦大麦蚕豆蚕豆大豆大豆草香木犀草香木犀酵母菌酵母菌鸡鸡大豆大豆烟草烟草大豆大豆秋水仙秋水仙人人胡胡萝萝卜卜番茄番茄马铃马铃薯薯人人小鼠小鼠叶叶叶叶叶叶根根愈愈伤组织伤组织叶叶叶叶花瓣花瓣种子种子种子种子叶叶悬悬浮浮细细胞胞叶叶花瓣花瓣叶叶悬悬浮浮细细胞胞叶叶悬悬浮浮细细胞胞悬悬浮浮细细胞胞悬悬浮浮细细胞胞叶叶根根悬悬浮浮细细胞胞叶叶原生原生质质体体血血红细红细胞胞悬悬浮浮细细胞胞叶叶悬悬浮浮细细胞胞叶叶腹水癌腹水癌细细胞胞原生原生质质体体叶叶根尖根尖纤维纤维肉瘤肉瘤细细胞胞畸胎瘤畸胎瘤
4、细细胞胞197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972几种几种细细胞融合成功的例子胞融合成功的例子4.植物融合植物融合细细胞成胞成长长状状态对态对比比,右瓶右瓶为为地面融合的地面融合的细细胞,左瓶中胞,左瓶中为为太空微重力太空微重力环环境下融合的境下融合的细细胞胞 5.动物细胞融合实验使用的小白鼠 6.三、三、动动植物植物细细胞的融合胞的融合过过程程植物植
5、物细细胞融合胞融合过过程程人造小鼠培育人造小鼠培育过过程示意程示意图图7.四、四、细细胞融合的意胞融合的意义义u理理论论上上说说任何任何细细胞,都有可能通胞,都有可能通过过体体细细胞胞杂杂交而成交而成为为新的生物新的生物资资源。源。这这 对对于种于种质资质资源的开源的开发发和利用具有深和利用具有深远远的意的意义义。u融合融合过过程程不存在有性不存在有性杂杂交交过过程中的种性隔离机制的限制程中的种性隔离机制的限制,为远缘为远缘物种物种间间 的的遗传遗传物物质质交交换换提供了有效途径。提供了有效途径。u体体细细胞胞杂杂交交产产生的生的杂杂种种细细胞含有来自双胞含有来自双亲亲的核外的核外遗传遗传系系
6、统统,在,在杂杂种的分种的分 裂和增殖裂和增殖过过程中双程中双亲亲的叶的叶绿绿体、体、线线粒体粒体DNA亦可亦可发发生重生重组组,从而,从而产产生新生新 的核外的核外遗传遗传系系统统。u淋巴淋巴细细胞胞杂杂交瘤和交瘤和单单克隆抗体的制克隆抗体的制备备。8.细细胞融合的基本原理胞融合的基本原理9.显显微微镜镜下下细细胞融合胞融合过过程程10.融合融合过过程中两个程中两个细细胞膜从彼此接触到破裂形成胞膜从彼此接触到破裂形成细细胞胞桥桥的的变变化化过过程程图图解解11.用用灭灭活的病毒活的病毒诱导诱导的的动动物物细细胞融合胞融合过过程示意程示意图图 12.细细胞融合的常用方法胞融合的常用方法13.一
7、、仙台病毒法一、仙台病毒法仙台病毒仙台病毒诱导细诱导细胞融合胞融合经经四个四个阶阶段:段:两种细胞在一起培养,加入病毒,在4条件下病毒附着在细胞 膜上。并使两细胞相互凝聚;在37中,病毒与细胞膜发生反应,细胞膜受到破环,此时需 要Ca2+和Mg2+,最适PH为8.0一8.2;细胞膜连接部穿通,周边连接部修复,此时需Ca2+和ATP;融合成巨大细胞,仍需ATP。14.病毒促使病毒促使细细胞融合的主要步胞融合的主要步骤骤如下:如下:1.两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近;2.通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透,胞质互相渗透;3.两个原生质体的细胞核互相融合,两个细胞融为
8、一体;4.进入正常的细胞分裂途径,分裂成含有两种染色体的杂种细胞。15.用用灭灭活的病毒活的病毒诱导诱导的的动动物物细细胞融合胞融合过过程示意程示意图图 16.u 优点是易得,用法简单,融合效果稳定。u聚乙二醇(PEG)结构为:HOH2C(CH20CH2)nCH2OH,分子量大于200小于6000者均可用作细胞融合剂。uPEG浓度以W/W;如将10克PEG与10mlEagLe氏液混合(假定1ml培养液为1g重),即成50PEG溶液。uPEG经高压灭菌后,与温热的Engle氏液混合。u通常用分子量低于1000的PEG作融合剂最好,50PEG溶液能产生最多杂交细胞。uPEG溶液在pH6.0时细胞融
9、合率最高。二、聚乙二醇(二、聚乙二醇(PEG)法)法17.聚乙二醇(聚乙二醇(PEG)法)法细细胞融合胞融合过过程程18.PEG的作用机理的作用机理:Kao等等认为认为,由于,由于PEG分子分子具有具有轻轻微的微的负负极性,故可以与具有正极性基极性,故可以与具有正极性基团团的水、蛋白的水、蛋白质质和碳水化合物等形成和碳水化合物等形成H键键,从而,从而在在在在质质膜之膜之间间形成分子形成分子桥桥,其,其结结果是使果是使细细胞胞质质膜膜发发生粘生粘连进连进而促使而促使质质膜的融合;另外,膜的融合;另外,PEG能增加能增加类类脂膜的流脂膜的流动动性,也使性,也使细细胞的核、胞的核、细细胞胞器器发发生
10、融合成生融合成为为可能。可能。PEG诱导诱导融合的特点融合的特点:其其优优点是融合成本低,勿需特殊点是融合成本低,勿需特殊设备设备;融合子;融合子产产生的异核率生的异核率较较高;融合高;融合过过程不受物种限程不受物种限制。其缺点是融合制。其缺点是融合过过程繁程繁琐琐,PEG可能可能对细对细胞有毒害。胞有毒害。19.聚乙二醇(聚乙二醇(PEG)法)法细细胞融合步胞融合步骤骤(1)将两种不同亲本细胞各5l06混匀;(2)离心沉淀,吸去上清液;(3)加1ml 50PEG溶液,用吸管吹打,使之与细胞接触1分钟;(4)加9ml 培养液,离心沉淀,吸去上清液;(5)加5ml 培养液,分别接种5个直径60m
11、m平皿,每个平皿加培养 液至 5ml,37的CO2培养箱中培养。(6)624小时后,换成选择培养液筛选杂交细胞。20.21.三、三、电电融合法融合法 电融合法是80年代出现的细胞融合技术,在直流电脉冲的诱导下,细胞膜表面的氧化还原电位发生改变,使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂,进而质膜开始连接,直到闭和成完整的膜,形成融合体。电电融合法的融合法的优优点:点:u融合率高、重复性强、对细胞伤害小;u装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察或录像观察融合过程;u免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强。22.电电融合的基本融合的基本过过程:程:细细胞膜的接触:胞膜的接触:当原生当原生质质体置于体置于
12、电导电导率很低的溶液中率很低的溶液中时时,电场电场通通电电后,后,电电流即通流即通过过原生原生质质体而不是通体而不是通过过溶液,其溶液,其结结果是原生果是原生质质体在体在电场电场作用下极化而作用下极化而产产生偶极子,从而使原生生偶极子,从而使原生质质体体紧紧密接触排列成串;密接触排列成串;膜的膜的击击穿:穿:原生原生质质体成串排列后,立即体成串排列后,立即给给予高予高频频直流脉冲就可以直流脉冲就可以使原生使原生质质膜膜击击穿,从而穿,从而导导致两个致两个紧紧密接触的密接触的细细胞融合在一起。胞融合在一起。23.电电融合融合诱导诱导法原理示意法原理示意图图24.杂杂种种细细胞的胞的筛选筛选25.
13、杂杂种种细细胞的胞的筛选筛选n原理:两种亲本细胞融合的混合物中可能有多种类型细胞,筛选的目的是获得优良的杂种细胞。n1)亲本 n2)同核体:同源原生质体的融合体n3)异核体:非同源的原生质体的融合体n4)多核体:含有双亲不同比例核物质的融合体n5)异胞质体:具有不同胞质来源的杂合细胞。n6)核质体:有细胞核而带有少量细胞质的亚原生质体26.u基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立的杂种筛选u基于营养缺陷型细胞所建立的杂种筛选u由温度敏感型细胞组成的杂种细胞的筛选u具有所需性状杂种细胞的筛选常用的常用的杂杂种种细细胞胞筛选筛选方法方法27.植物细胞筛选方式1)遗传互补筛选法:利用每一亲本贡献一个功能正
14、常等位基因,纠正另一亲本的缺陷,令杂种细胞表现正常。n 如亲本1:叶绿体缺陷型 亲本2:光致死型 两亲本在光照下一种死亡,另一种呈白 色,融合细胞长成植株呈绿色,并能成长28.n2)抗性互补筛选法:利用亲本细胞原生质体对抗生素、除草剂及其它有毒物质抗性差异选择杂种细胞。n如:n亲本1:对放线菌素D抗性,但在MS培养基上不能超过50个世代n亲本2:对放线菌素D很敏感,但能在MS上生长n杂种细胞能在含有放线菌素的MS培养基上生长,而亲本和其它细胞死亡29.3)利用物理特性筛选法:根据亲本的原生质体大小、颜色、漂浮密度及电泳迁移率、形成的愈伤组织的差异筛选杂种细胞。亲本1:用异硫氰酸荧光素染色原生质
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