单核苷酸多态性及其应用精选PPT.ppt
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1、关于单核苷酸多态性及其关于单核苷酸多态性及其应用应用第1页,讲稿共44张,创作于星期日SNP的概念的概念 单核苷酸多态性(单核苷酸多态性(单核苷酸多态性(单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)是指基因组DNADNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性。的多态性。同一物种不同个体间染色体上遗传密码单个碱基同一物种不同个体间染色体上遗传密码单个碱基的变化,主要表现为基因组核苷酸水平上的变异引起的变化,主要表现为基因组核苷酸水平上的变异引起的的DNA序列多态性序列多态性 。第2页,讲稿共44张,创作于星期日Singl
2、e nucleotide polymorphism第3页,讲稿共44张,创作于星期日SNP的特征 SNP是人类可遗传的变异中最常出现的一种,占所有是人类可遗传的变异中最常出现的一种,占所有已知多态性的已知多态性的90%90%以上,在人类基因组中广泛存在,人类以上,在人类基因组中广泛存在,人类DNA中每中每300-1000bp300-1000bp就有一个就有一个SNP.SNP.因此,一个人类个体大约携带300万万-1000-1000万个万个SNPsSNPs。第4页,讲稿共44张,创作于星期日SNPSNP的特征的特征一个SNPSNP表示在基因组某个位点上一个核苷酸的变化,表示在基因组某个位点上一个
3、核苷酸的变化,作为一种碱基的替换,大多数为转换(作为一种碱基的替换,大多数为转换(CTCT,GAGA),也),也可能是颠换。可能是颠换。具有转换型变异的SNPSNP约占SNP总量的总量的2 23 3左右。左右。转换的发生率总是明显高于其它几种变异,而且在转换的发生率总是明显高于其它几种变异,而且在CGCG序列上出现最为频繁,多是发生序列上出现最为频繁,多是发生CT的转换,原因是CG中的中的C C是甲基化的,它能自发的脱氨基而替换为胸腺嘧是甲基化的,它能自发的脱氨基而替换为胸腺嘧啶。啶。第5页,讲稿共44张,创作于星期日 SNP SNP大都表现为二等位基因(大都表现为二等位基因(bialleti
4、c)多态性,即在该位置只存在两种不同的碱基。即在该位置只存在两种不同的碱基。位于染色体上某一区域的一组相关联的SNPSNP等位等位位点被称作单倍型位点被称作单倍型(haplotype)(haplotype),相邻,相邻SNPsSNPs的等位位点的等位位点倾向于以一个整体遗传给后代倾向于以一个整体遗传给后代.第6页,讲稿共44张,创作于星期日第7页,讲稿共44张,创作于星期日根据SNP在基因组中的分布位置可分为:基因编码区SNP(cSNP)基因调控区SNP(pSNP)基因间随机编码区SNP(rSNP)等三类。因为编码区内的变异率占周围序列的1/5,cRNP的总量显著少于其他两类SNPs。第8页,
5、讲稿共44张,创作于星期日 cSNP又可分为2种:同义cSNP(synonymous cSNP):非同义cSNP(non-synonymous cSNP)第9页,讲稿共44张,创作于星期日 同义同义cSNPcSNP:SNPSNP所导致的编码序列改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列,突变碱基与未突变碱基的含义相同;非同义非同义cSNPcSNP:指碱基序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋白质序指碱基序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变,从而影响蛋白质的功能。这种改变常常是列发生改变,从而影响蛋白质的功能。这种改变常常是导致生物性状改变的直接原因。导致生物性状改变的直接原因。位于基因调控
6、区的位于基因调控区的SNPSNP则会影响基因表达量的多少,因此,这两类SNPSNP在功能和疾病发生发展方面具在功能和疾病发生发展方面具有更重要的意义。有更重要的意义。第10页,讲稿共44张,创作于星期日SNPSNP的检测方法的检测方法 单链构象多态性单链构象多态性单链构象多态性单链构象多态性(single-strand conformational(single-strand conformational polymorphism,SSCP)polymorphism,SSCP)原理:单链DNA的折叠结构是由单核苷酸序列决定的,当某一个碱基发生突变时,便会直接影响该链的构象,非变性聚丙烯酰胺凝胶
7、电泳时迁移率会发生改变。第11页,讲稿共44张,创作于星期日SNP的检测方法的检测方法变性梯度凝胶电泳(变性梯度凝胶电泳(变性梯度凝胶电泳(变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)electrophoresis,DGGE)原理:当双链当双链DNADNA在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性温变性温度一致的凝胶位置时,度一致的凝胶位置时,DNA发生部分解链,电泳迁移发生部分解链,电泳迁移率下降,率下降,DNADNA链中有一个碱基改变时,会在不同的时链中有一个碱基改变时,会在不同的时间发
8、生解链,因影响电泳速度变化的程度而被分离。间发生解链,因影响电泳速度变化的程度而被分离。第12页,讲稿共44张,创作于星期日SNPSNP的检测方法的检测方法 TaqmanTaqmanTaqmanTaqman法法法法 以荧光共振能量传递以荧光共振能量传递(fluorescent resonance energy(fluorescent resonance energy transfer,FRET)transfer,FRET)为基础的检测方法。为基础的检测方法。在在PCRPCR反应中,将供者反应中,将供者-受者染料对分别结合到受者染料对分别结合到TaqmanTaqman探针的两端,探针的两端,探针
9、未与目标序列结合时,通过探针未与目标序列结合时,通过FRETFRET作用使供者不发荧光;完全互补作用使供者不发荧光;完全互补配对后,由于配对后,由于Taq DNATaq DNA聚合酶具有聚合酶具有55核酸酶的活性,可将供者从探针核酸酶的活性,可将供者从探针上切下来从而发出荧光。如果探针与目标序列中存在错配碱基,就会减上切下来从而发出荧光。如果探针与目标序列中存在错配碱基,就会减少探针与目标序列结合的紧密程度及少探针与目标序列结合的紧密程度及Taq DNATaq DNA聚合酶切割供者的活性,聚合酶切割供者的活性,也就影响了供者的荧光释放量,从而使碱基突变链和正常链得以也就影响了供者的荧光释放量,
10、从而使碱基突变链和正常链得以区分。区分。第13页,讲稿共44张,创作于星期日供者受者53Taqman 探针探针第14页,讲稿共44张,创作于星期日供者受者53Taqman 探针探针第15页,讲稿共44张,创作于星期日供者受者53引物目标序列第16页,讲稿共44张,创作于星期日受者53引物供者目标序列第17页,讲稿共44张,创作于星期日SNPSNP的检测方法的检测方法 分子信标分子信标分子信标分子信标(molecular beacon)(molecular beacon)(molecular beacon)(molecular beacon)法法法法 分子信标是一个分子信标是一个U U型的单链核
11、苷酸探针(探针序列内部可有一型的单链核苷酸探针(探针序列内部可有一定程度的互补配对),在探针两端也加上供者定程度的互补配对),在探针两端也加上供者-受者染料对,受者染料对,U U型探型探针使两染料靠近,通过针使两染料靠近,通过FRETFRET作用使供者不发荧光。当探针与作用使供者不发荧光。当探针与目标序列完全互补配对后,两染料分离,使得供者的荧光亮目标序列完全互补配对后,两染料分离,使得供者的荧光亮增加,增加,如果目标序列中存在错配碱基,就会影响探针与其结合,如果目标序列中存在错配碱基,就会影响探针与其结合,从而影响到供者的荧光亮,使碱基突变链和正常链得以区分。从而影响到供者的荧光亮,使碱基突
12、变链和正常链得以区分。第18页,讲稿共44张,创作于星期日供者受者第19页,讲稿共44张,创作于星期日供者受者第20页,讲稿共44张,创作于星期日焦磷酸测序法 焦磷酸测序法(pyrosequencing)(pyrosequencing)是一种不依赖平是一种不依赖平板胶或毛细管电泳,不依赖板胶或毛细管电泳,不依赖DNA的荧光标记的荧光标记/激发/检检测体系的序列分析技术,适用于已知序列的测体系的序列分析技术,适用于已知序列的DNADNA片段进行验证分析,适用于已知SNPSNP的序列验证及基因分型。的序列验证及基因分型。第21页,讲稿共44张,创作于星期日 焦磷酸测序法主要是由四种酶催化同一反应体
13、系中的酶焦磷酸测序法主要是由四种酶催化同一反应体系中的酶级联反应级联反应:包括包括DNADNA聚合酶、硫酸化酶、萤光素酶和双磷酸酶;反应底物为反应底物为adenosine 5adenosine 5phosphosulfate(APS)phosphosulfate(APS)和萤和萤光素。光素。反应体系还包括待测序的反应体系还包括待测序的DNA单链和测序引物单链和测序引物。第22页,讲稿共44张,创作于星期日 在每一轮测序反应中,加入一种在每一轮测序反应中,加入一种dNTPdNTP。如该如该dNTPdNTP与模板配对,聚合酶就可以催化该与模板配对,聚合酶就可以催化该dNTPdNTP掺入到引物链掺入
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