动物细胞融合讲稿.ppt
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1、关于动物细胞融合第一页,讲稿共二十八页哦动物细胞融合动物细胞融合细胞融合是正常的生命活动细胞融合是正常的生命活动 受精作用受精作用两个细胞正在融合两个细胞正在融合第二页,讲稿共二十八页哦动物细胞融合基本过程:动物细胞融合基本过程:第三页,讲稿共二十八页哦诱导方法:诱导方法:诱导方式诱导方式物理法:物理法:化学法:化学法:生物法:生物法:灭活的病毒灭活的病毒电刺激电刺激聚乙二醇聚乙二醇PEGPEG第四页,讲稿共二十八页哦 聚乙二醇聚乙二醇PEG具有强烈的吸水性以及凝聚和具有强烈的吸水性以及凝聚和沉淀蛋白质的作用,能够有效地促进植物原生质沉淀蛋白质的作用,能够有效地促进植物原生质体和动物细胞的融合
2、。在不同种类的动物细胞混体和动物细胞的融合。在不同种类的动物细胞混合液中加入聚乙二醇,就会发生细胞合液中加入聚乙二醇,就会发生细胞凝集作用凝集作用;在稀释和除去聚乙二醇的过程中,就会发生细胞在稀释和除去聚乙二醇的过程中,就会发生细胞融合。聚乙二醇诱导细胞融合的机理,目前还不融合。聚乙二醇诱导细胞融合的机理,目前还不太清楚。聚乙二醇是化学试剂,使用起来很方便,太清楚。聚乙二醇是化学试剂,使用起来很方便,诱导细胞融合的频率比较高,但是它诱导细胞融合的频率比较高,但是它有一定毒性有一定毒性,对有些细胞对有些细胞(如卵细胞如卵细胞)不适用。不适用。聚乙二醇聚乙二醇PEGPEG诱导融合诱导融合第五页,讲
3、稿共二十八页哦实验原理:实验原理:利用利用PEG介导的动物细胞融合,其实验原理到目前介导的动物细胞融合,其实验原理到目前为止还没有完全定论。学者们一般认为,为止还没有完全定论。学者们一般认为,PEG改变各改变各类细胞的膜结构,使两细胞相互接触部位的膜脂双层类细胞的膜结构,使两细胞相互接触部位的膜脂双层中磷脂分子发生疏散、进而使其结构发生重排,再加中磷脂分子发生疏散、进而使其结构发生重排,再加上膜脂双层的相互亲合以及彼此间表面张力的作用,上膜脂双层的相互亲合以及彼此间表面张力的作用,引起相临的重排质膜,在修复时相互合并在一起引起相临的重排质膜,在修复时相互合并在一起,使两使两细胞的胞质沟通细胞的
4、胞质沟通,从而造成相互接触的细胞之间发生融从而造成相互接触的细胞之间发生融合。合。第六页,讲稿共二十八页哦 利用利用PEG介导细胞融合介导细胞融合,其融合效果受以下其融合效果受以下几种因素的影响:几种因素的影响:1.PEG的分子量与浓度的分子量与浓度:2.细胞融合效果与细胞融合效果与PEG的分子量及其浓度成正的分子量及其浓度成正比;但比;但PEG的分子量越大、浓度越高的分子量越大、浓度越高,对细胞对细胞的毒性也就越大。为了兼顾二者,在实验时常的毒性也就越大。为了兼顾二者,在实验时常常采用的常采用的PEG分子量一般为分子量一般为10004000,浓度,浓度一般为一般为4060%。第七页,讲稿共二
5、十八页哦2.PEG的的pH值值:经验证,经验证,PEG的的pH值在值在8.08.2之间融合效果最之间融合效果最好。好。3.PEG的处理时间的处理时间:处理时间越长,融合效果越好处理时间越长,融合效果越好,但对细胞的毒害但对细胞的毒害也就越大。故一般将处理时间限制在也就越大。故一般将处理时间限制在1分钟之内。分钟之内。本实验中细胞融合后无需继续培养本实验中细胞融合后无需继续培养,故处理时间可故处理时间可适当放宽至数分钟。适当放宽至数分钟。第八页,讲稿共二十八页哦4.融合时的温度融合时的温度:由于生物膜膜的流动性与温度成正比,故细胞的由于生物膜膜的流动性与温度成正比,故细胞的融合效果也与温度成正比
6、。因此,为了获得更好的融融合效果也与温度成正比。因此,为了获得更好的融合效果合效果,在细胞可能承受的温度范围内可适当提高处在细胞可能承受的温度范围内可适当提高处理的温度。对于哺乳动物的细胞理的温度。对于哺乳动物的细胞,一般采用的温度为一般采用的温度为3840。而本次试验基本在而本次试验基本在37 的条件下进行。的条件下进行。第九页,讲稿共二十八页哦实验选材:实验选材:本次试验选用本次试验选用鸡的外周血鸡的外周血做细胞融合材料做细胞融合材料,这是因为这是因为:1.鸡血细胞具有细胞核,便于对融合细胞进行鉴别;鸡血细胞具有细胞核,便于对融合细胞进行鉴别;2.实验材料便宜、易得,避免了用培养的细胞株做
7、细实验材料便宜、易得,避免了用培养的细胞株做细胞融合实验材料所耗的实验成本和精力;胞融合实验材料所耗的实验成本和精力;3.细胞融合与否,可通过观察细胞内核的数目来进细胞融合与否,可通过观察细胞内核的数目来进行鉴别。若细胞内只有一个核,定为未融合细胞;行鉴别。若细胞内只有一个核,定为未融合细胞;有二至多个核,定为融合细胞。有二至多个核,定为融合细胞。第十页,讲稿共二十八页哦实验步骤:实验步骤:取新鲜鸡血取新鲜鸡血,制成体积分数制成体积分数10%鸡红细胞悬液。鸡红细胞悬液。称称0.5gPEG(MW=4000),熔化。尽快加入,熔化。尽快加入0.5ml预热预热80的的Hanks 液,制成质量分数液,
8、制成质量分数50%PEG,轻轻摇匀,散温,轻轻摇匀,散温,置置37恒温水浴箱中备用恒温水浴箱中备用(以防冷却后会形成结晶)(以防冷却后会形成结晶)。吸取吸取1 mL 悬液置刻度离心管中悬液置刻度离心管中,另加另加5 mLHanks 液液,混匀混匀,离心(离心(1000r/min)5min。第十一页,讲稿共二十八页哦吸取吸取0.5mlPEG加入鸡红细胞沉淀管内,加入鸡红细胞沉淀管内,1min内加入离心管中,边滴边摇晃内加入离心管中,边滴边摇晃(此过程必须在(此过程必须在37 水浴箱中进行)水浴箱中进行)。静置静置1min后,加入后,加入9mlHanks液,轻轻液,轻轻吹打混匀,在吹打混匀,在37
9、 水浴箱中放置水浴箱中放置10min。吸弃上清液,使沉淀物松散,置吸弃上清液,使沉淀物松散,置37水浴箱中维持。水浴箱中维持。第十二页,讲稿共二十八页哦离心(离心(1000r/min)5min,吸弃上清吸弃上清液,加入液,加入1ml不含血清的不含血清的1640培养液,培养液,混匀后取混匀后取1滴悬液制成临时装片。滴悬液制成临时装片。用质量分数为用质量分数为0.12%的次甲基蓝染色。镜检。的次甲基蓝染色。镜检。离心(离心(1000r/min)5min,吸弃上清液,吸弃上清液,加入加入3ml含小牛血清的含小牛血清的1640培养液,轻轻吹培养液,轻轻吹打混匀,置打混匀,置37 水浴箱中温育水浴箱中温
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