食品中菌落总数和大肠菌群的检测课件.ppt
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1、关于食品中菌落总数和大肠菌群的检测第1页,此课件共56页哦 目前,食品卫生标准中的微生物指标一般分为目前,食品卫生标准中的微生物指标一般分为菌落总数菌落总数、大肠菌群和致病菌大肠菌群和致病菌三项。三项。细菌计数细菌计数 食品中菌落总数通常指食品中菌落总数通常指1g,1ml或或1cm2面积食品上的细菌数目而言的,而不考虑其种类。面积食品上的细菌数目而言的,而不考虑其种类。由于检测计数方法的不同由于检测计数方法的不同,一般有两种表示方法(一般有两种表示方法(菌落总数菌落总数和和细菌总数细菌总数)。)。食品卫生标准中的微生物指标概论食品卫生标准中的微生物指标概论第2页,此课件共56页哦菌落总数:菌落
2、(Colony)菌落菌落(colony):生长在固体培养基上,来源生长在固体培养基上,来源于一个细胞,肉眼可见的细胞群体。于一个细胞,肉眼可见的细胞群体。第3页,此课件共56页哦 一一种种是是在在严严格格规规定定条条件件下下(样样品品处处理理,培培养养基基及及其其pH培培养养温温度度与与时时间间、计计数数方方法法等等),使使适适应应这这些些条条件件的的每每一一个个活活菌菌细细胞胞必必须须而而且且只只能能生生成成一一个个肉肉眼眼可可见见的的菌菌落落,经经过过计计数数所所获获得得的的结结果果称称为为该该食食品品的的菌落总数菌落总数。第4页,此课件共56页哦另一种另一种是将食品经过适当处理(溶解和稀
3、释)是将食品经过适当处理(溶解和稀释)后,在显微镜下对细菌细胞数进行直接计数,后,在显微镜下对细菌细胞数进行直接计数,这样计数的结果,既包括活菌,也包括尚未这样计数的结果,既包括活菌,也包括尚未被分解的死菌体,因此称为被分解的死菌体,因此称为细菌总数细菌总数。目前我国食品卫生标准中规定的细菌总目前我国食品卫生标准中规定的细菌总数实际上是指数实际上是指菌落总数菌落总数。即指的是在平板计。即指的是在平板计数培养基上长出的菌落数。数培养基上长出的菌落数。第5页,此课件共56页哦那么检测食品中的菌落总数有何卫生学意义呢?那么检测食品中的菌落总数有何卫生学意义呢?一一方方面面,它它可可以以作作为为食食品
4、品被被污污染染程程度度的的标标志志。检检测测食食品品中中的的菌菌落落总总数数,可可以以了了解解食食品品在在生生产产中中,从从原原料料加加工工到到成成品品包包装装受受外外界界污污染染的的情情况况从从而而反反映映食食品品的的卫卫生生质质量量。一一般般来来说说、菌菌落落总总数数越越多多,说说明明食食品品的的卫卫生生质质量量越越差差,遭遭受受病病原原菌菌污污染染的的可可能能性性越越大大。而而菌菌落落总总数数仅仅少少量量存存在在时时,病病原原菌菌污污染染的的可可能性就会降低或者几乎不存在。能性就会降低或者几乎不存在。许许多多实实验验结结果果表表明明,食食品品中中细细菌菌总总数数能能够够反反映映出出食食品
5、品的的新新鲜鲜程程度度、是是否否变变质质以以及及生生产产过过程程的的一一般般卫卫生生状状况况等等。一一般般来来讲讲,食食品品中中细细菌菌总总数数越越多多,则则表表明明该该食食品品污污染染程程度度越越重重,腐腐败败变变质质的的可能性越大。可能性越大。第6页,此课件共56页哦另另一一方方面面,它它可可以以用用来来预预测测食食品品可可能能存存放放的的期期限限程程度度。如如实实验验表表明明,菌菌数数为为105cfu/cm2的的鱼鱼,在在0下下可可保保持持6d,而而菌数为菌数为103cfu/cm2时,保存期可达时,保存期可达12d。但但上上述述规规则则也也有有例例外外,有有些些食食品品成成品品的的菌菌落
6、落总总数数并并不不高高,但但由由于于已已有有细细菌菌繁繁殖殖并并已已产产生生了了毒毒素素,且且毒毒素素性性状状稳稳定定,仍仍存存留留于于食食品品中中;再再有有一一些些食食品品如如酸酸泡泡菜菜和和酸酸乳乳等等,本本身身就就是是通通过过微微生生物物的的作作用用而而制制成成的的,且且是是活活菌制品。菌制品。第7页,此课件共56页哦 自自然然界界细细菌菌的的类类很很多多,各各种种细细菌菌的的生生理理特特性性和和所所要要求求的的生生活活条条件件不不尽尽相相同同,(如如嗜嗜温温菌菌30-37,4.83hr;嗜嗜冷冷菌菌 20-25 5-7d或或5-10 10-14d;嗜嗜热热菌菌 45-55 2-3天天)
7、如如果果要要检检验验样样品品中中所所有有种种类类,必必须须用用不不同同培培养养基基及及不不同同培培养养条条件件去去满满足足其其要要求求,才才能能把把各各种种细细菌菌都都检检验验出出来来,这这样样工工作作量量将将会会很大。很大。我我们们也也知知道道,自自然然界界尽尽管管细细菌菌种种类类很很多多,但但异异养养、中中温温、好好气气性性细细菌菌占占绝绝大大多多数数。因因此此,严严格格讲讲,用用这这种种方方法法所所得得到到的的结结果果,主主要要是是一一些些能能在在平平板板计计数数琼琼脂脂培培养养基基上上生生长长的的,好好氧氧性性嗜嗜温温细细菌菌的的菌菌落落总总数数。但但是是把把它它们们作作为为细细菌菌总
8、总数数已已得得到到公公认认。这这不不仅仅在在食食品品的的卫卫生生检检验验中中,而而且且在在一一切切微微生生物物区区系系分分析析中,都把它们作为了细菌总数的指标。中,都把它们作为了细菌总数的指标。注意:是并不是所有食品都规定细菌指标,如酸乳、酸泡菜等。注意:是并不是所有食品都规定细菌指标,如酸乳、酸泡菜等。第8页,此课件共56页哦因因此此,菌菌落落总总数数的的测测定定对对评评价价食食品品的的新新鲜鲜度度和和卫卫生生质质量量有有着着一一定定的的卫卫生生指指标标的的作作用用,但但本本能能单单凭凭此此一一项项指指标标来来判判定定食食品品的的卫卫生生质质量量,还还必必须须配配合合大大肠肠菌菌群群和和致致
9、病病菌菌等等检检验验,才才能能作出比较全面、准确的评价。作出比较全面、准确的评价。第9页,此课件共56页哦一、菌落总数测定法一、菌落总数测定法菌落总数菌落总数(aerobicplatecount)食品检样经过处理,在一定条件下培养后食品检样经过处理,在一定条件下培养后(如培养基成分、培养温度和时间、如培养基成分、培养温度和时间、pH、需氧、需氧性质等性质等),所得,所得1mL(或或1g)检样中形成菌落的总数。本标准规定的培养条件下所得结果,只包检样中形成菌落的总数。本标准规定的培养条件下所得结果,只包括一群在平板计数琼脂上生长发育的嗜中温需氧菌或兼性厌氧菌的菌落总数。括一群在平板计数琼脂上生长
10、发育的嗜中温需氧菌或兼性厌氧菌的菌落总数。第10页,此课件共56页哦GB/T 4789.2-2010本标准与本标准与GB/T4789.2-2008相比主要修改如下:相比主要修改如下:修改了标准的中英文名称;修改了标准的中英文名称;(食品安全国家标准食品微生物学检验 菌落总数测定/食品卫生微生物学检验 菌落总数测定)修改了菌落总数计算公式中的解释;修改了菌落总数计算公式中的解释;修改了培养基和试剂;修改了培养基和试剂;删除了第二法删除了第二法菌落总数菌落总数PetrifilmTM测试片法。测试片法。(培养基由营养琼脂改为平板计数琼脂;培养基由营养琼脂改为平板计数琼脂;菌落总数计算公式进行了修改;
11、菌落总数计算公式进行了修改;增加了第二法增加了第二法“菌落总数菌落总数PetrifilmTM测试片法测试片法”;)-2008第11页,此课件共56页哦3.设备和材料设备和材料 3.1恒温培养箱:恒温培养箱:361301。3.2冰箱:冰箱:25。3.3恒温水浴箱:恒温水浴箱:461。3.4天平:感量天平:感量0.1g。3.5均质器均质器3.6振荡器振荡器3.7无菌吸管:无菌吸管:1mL(具(具0.01mL刻度)、刻度)、10mL(具(具0.1mL刻度)或微量移液器及其吸头。刻度)或微量移液器及其吸头。3.8无菌锥形瓶:容量为无菌锥形瓶:容量为250mL、500mL。3.9无菌培养皿:直径为无菌培
12、养皿:直径为90mm。3.10pH计或计或pH比色管或精密比色管或精密pH试纸。试纸。3.11放大镜或放大镜或/和菌落计数器或和菌落计数器或PetrifilmTM自动判自动判读仪。读仪。3.12无菌刀、剪子、镊子等无菌刀、剪子、镊子等。第12页,此课件共56页哦4培养基和试剂培养基和试剂4.1平板计数琼脂培养基平板计数琼脂培养基(PlatecountagarPCA),见附录,见附录A中中A.1。pH7.00.2 4.2磷酸盐缓冲稀释液,见附录磷酸盐缓冲稀释液,见附录A中中A.2。pH7.24.3无无菌菌生生理理盐盐水水,见见附附录录A中中A.3:称称取取8.5g氯氯化化钠钠溶溶于于1 0 0
13、0 m L蒸蒸 馏馏 水水 中中,1 2 1高高 压压 灭灭 菌菌1 5 m i n。(4.41mol/L氢氧化钠(氢氧化钠(NaOH):称取):称取40g氢氧化钠溶于氢氧化钠溶于1000mL水中。水中。4.51mol/L盐酸(盐酸(HCl):移取浓盐酸):移取浓盐酸90mL,用蒸馏水稀释至,用蒸馏水稀释至1000mL4.6PetrifilmTM菌落总数测试片(菌落总数测试片(aerobiccountplate)和压板。)和压板。)4.775%乙醇。乙醇。区别:区别:pH值(值(08:pH7.00.2;03:pH7.27.4)第13页,此课件共56页哦细细 菌菌 学学 检检 验验 程程 序序-
14、细菌总数细菌总数5、第一法第一法平板菌落计数法平板菌落计数法第14页,此课件共56页哦6、操作步骤、操作步骤6.1.1固体和半固体食品:固体和半固体食品:以无菌操作称取以无菌操作称取25g样品,样品,放入于装有放入于装有225mL磷酸盐缓冲稀释液或磷酸盐缓冲稀释液或0.85生理盐生理盐水的无菌均质杯内,于水的无菌均质杯内,于8000r/min10000r/min均质均质1min2min,制成,制成1:10样品匀液;或放入于样品匀液;或放入于225mL稀释液的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打稀释液的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min2min制成制成1:10的样品匀液。的样品匀液。6.1.2
15、液体样品:液体样品:以无菌吸管吸取样品以无菌吸管吸取样品25mL放入装放入装有有225mL磷酸盐缓冲稀释液或生理盐水的无菌锥形瓶磷酸盐缓冲稀释液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成中,充分混匀,制成1:10的样品匀液(的样品匀液(表面取样的样品按一定的比例制成表面取样的样品按一定的比例制成1:1样品匀液和样品匀液和/或或1:10样品匀液。样品匀液。)。)。6.1样品的稀释样品的稀释第15页,此课件共56页哦6.1.3用用1mL无菌吸管或微量移液器吸取无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液样品匀液1.0mL,沿管壁缓慢注于装有,沿
16、管壁缓慢注于装有9mL稀释液的无菌试管中(注稀释液的无菌试管中(注意吸管尖端不要触及稀释液),振摇试管或换用意吸管尖端不要触及稀释液),振摇试管或换用1支无菌吸管支无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成反复吹打使其混合均匀,制成1:100的样品匀液。的样品匀液。6.1.4另取另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头,按上述操作无菌吸管或微量移液器吸头,按上述操作顺序,做顺序,做10倍递增样品匀液,如此每递增稀释一次,即换倍递增样品匀液,如此每递增稀释一次,即换用用1次次1mL灭菌吸管或吸头。灭菌吸管或吸头。6.1.5根据对样品污染情况的估计,选择根据对样品污染情况的估计,选择23个适宜稀释个适宜稀释度的
17、样品匀液(液体样品可包括原液),分别在做度的样品匀液(液体样品可包括原液),分别在做10倍递增倍递增稀释的同时,吸取稀释的同时,吸取1.0mL样品匀液于无菌平皿内,每个稀释样品匀液于无菌平皿内,每个稀释度做两个平皿。同时分别取度做两个平皿。同时分别取1mL稀释液加入稀释液加入两个无菌平皿两个无菌平皿作作空白对照。空白对照。6.1.6样品匀液移入平皿后,应及时将凉至样品匀液移入平皿后,应及时将凉至46平板计数平板计数琼脂培养基琼脂培养基(可放置于可放置于461恒温水浴箱中保温恒温水浴箱中保温)注入平皿注入平皿约约15mL20mL,并转动平皿使混合均匀。同时将平板计,并转动平皿使混合均匀。同时将平
18、板计数琼脂培养基倾入数琼脂培养基倾入加有加有1.0mL空白稀释液空白稀释液的无菌平皿内作的无菌平皿内作对照。对照。第16页,此课件共56页哦6.2培养培养6.2.1琼脂凝固后,将琼脂凝固后,将平板翻转平板翻转,361培养培养箱内培养箱内培养48h2h。水产品采用水产品采用301培养培养72h3h(08新增新增)。6.2.2琼脂凝固后,如果怀疑样品中含有在琼脂琼脂凝固后,如果怀疑样品中含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时,可在表面覆盖一培养基表面弥漫生长的菌落时,可在表面覆盖一薄层琼脂培养基(约薄层琼脂培养基(约4mL),并在报告上记录该),并在报告上记录该操作,待覆盖层凝固,翻转平板,按操作,
19、待覆盖层凝固,翻转平板,按6.2.1条件进条件进行操作行操作 第17页,此课件共56页哦6.3菌落计数菌落计数 可用肉眼观察,必要时用放大镜或菌落计数可用肉眼观察,必要时用放大镜或菌落计数器,记录相应的菌落数量和稀释倍数。菌落计数器,记录相应的菌落数量和稀释倍数。菌落计数以菌落形成单位(以菌落形成单位(colonyformingunits,CFU)表示。表示。6.3.1平板菌落数的选择平板菌落数的选择选取菌落数在选取菌落数在30CFU300CFU个之间、无个之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于低于30CFU个菌落的平板记录具体菌落数,大于个菌落的平板记录
20、具体菌落数,大于300的可记的可记录为多不可计录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用。每个稀释度的菌落数应采用两个两个平板平均数。平板平均数。第18页,此课件共56页哦6.3.2其中一个平板有较大片状菌落生长时其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数;若度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半,而其余一半片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘,即可计算半个平板后乘2,代表,代表全平板菌落数。全平板菌落数。6.3.3当平板上出现菌落间无明显界线的
21、链状生长时,当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,即将每条链作为一个菌落计数。如有链状菌落生长时即将每条链作为一个菌落计数。如有链状菌落生长时(菌菌落之间无明显界线落之间无明显界线),若仅有一条链,可视为一个菌,若仅有一条链,可视为一个菌落;如果有不同来源的几条链,则应将每条链作为一落;如果有不同来源的几条链,则应将每条链作为一个菌落计。个菌落计。第19页,此课件共56页哦 1、平皿分、平皿分4部分点数(见图)部分点数(见图)2、求同一、求同一稀释度的平均菌落数稀释度的平均菌落数 如:如:A1数数 +A2数数 26.4、菌落计数方法、菌落计数方法第20页,此课件共56页哦1.若若只有一个稀
22、释度平板上的菌落数在适宜计数范围内只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内,计算两个平,计算两个平板菌落数的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数,作为每克(毫板菌落数的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数,作为每克(毫升)中菌落总数结果。升)中菌落总数结果。(见表例(见表例1)。)。2.若若有两个连续稀释度在适宜计数范围内有两个连续稀释度在适宜计数范围内(30300个菌落)时,按如下个菌落)时,按如下公式计算:公式计算:N=C/(n1+0.1n2)d式中:式中:N样品中菌落数;样品中菌落数;C平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和;平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和;n1第一稀释度(低
23、稀释倍数)平板个数;第一稀释度(低稀释倍数)平板个数;n2适宜范围菌落数的第二稀释度(高稀释倍数)平板个数;适宜范围菌落数的第二稀释度(高稀释倍数)平板个数;d稀释因子(第一稀释度);稀释因子(第一稀释度);7.结果的表述结果的表述7.1菌落总数的计算方法:菌落总数的计算方法:第21页,此课件共56页哦示例:示例:稀释度稀释度1:100(第一稀释度)(第一稀释度)1:1000(第二稀释度)(第二稀释度)菌落数菌落数232,24433,35N=C/(n1+0.1n2)d(232+244+33+35)/(2+0.12)10-2=544/0.022=24727上述数据经上述数据经“四舍五入四舍五入”
24、后,表示为后,表示为25000或或2.5104。3.若所有平均菌落数均大于若所有平均菌落数均大于300,则应按稀释度最高的平均菌落,则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表例数乘以稀释倍数报告之(见表例4)。)。第22页,此课件共56页哦 4.若所有稀释度的平均菌落数若所有稀释度的平均菌落数均小于均小于30,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(稀释倍数报告之(见表例见表例5)5.若所有稀释度的平均菌落数若所有稀释度的平均菌落数均不在均不在30-300之间之间,其中一,其中一 部分大于部分大于300或小或小于于30时,则以最接近时,则以最
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