单核苷酸多态性及其应用PPT讲稿.ppt
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1、单核苷酸多态性及其应用单核苷酸多态性及其应用第1页,共43页,编辑于2022年,星期五SNP的概念的概念 单核苷酸多态性(单核苷酸多态性(单核苷酸多态性(单核苷酸多态性(single nucleotide single nucleotide polymorphism,SNPpolymorphism,SNP)是指基因组是指基因组DNADNA序列中由于单个核苷酸的突变而引序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性。起的多态性。同一物种不同个体间染色体上遗传密码单个碱基同一物种不同个体间染色体上遗传密码单个碱基的变化,主要表现为基因组核苷酸水平上的变异引起的变化,主要表现为基因组核苷酸水平上的变异引起
2、的的DNADNA序列多态性序列多态性 。第2页,共43页,编辑于2022年,星期五Single nucleotide polymorphism第3页,共43页,编辑于2022年,星期五SNP的特征 SNPSNP是人类可遗传的变异中最常出现的一种,占所是人类可遗传的变异中最常出现的一种,占所有已知多态性的有已知多态性的90%90%以上,在人类基因组中广泛存在,人以上,在人类基因组中广泛存在,人类类DNADNA中每中每300-1000bp300-1000bp就有一个就有一个SNP.SNP.因此,一个人类个体大约携带因此,一个人类个体大约携带300300万万-1000-1000万个万个SNPsSNP
3、s。第4页,共43页,编辑于2022年,星期五SNPSNP的特征的特征 一个一个SNPSNP表示在基因组某个位点上一个核苷酸的变化,表示在基因组某个位点上一个核苷酸的变化,作为一种碱基的替换,大多数为转换(作为一种碱基的替换,大多数为转换(C CT T,G GA A),),也可能是颠换。也可能是颠换。具有转换型变异的具有转换型变异的SNPSNP约占约占SNPSNP总量的总量的2 23 3左右。左右。转换的发生率总是明显高于其它几种变异,而且在转换的发生率总是明显高于其它几种变异,而且在CGCG序列上出现最为频繁,多是发生序列上出现最为频繁,多是发生C CT T的转换,原因是的转换,原因是CGC
4、G中中的的C C是甲基化的,它能自发的脱氨基而替换为胸腺嘧啶。是甲基化的,它能自发的脱氨基而替换为胸腺嘧啶。第5页,共43页,编辑于2022年,星期五 SNP SNP大都表现为二等位基因(大都表现为二等位基因(bialletic)bialletic)多态性多态性,即在该位置只存在两种不同的碱基。即在该位置只存在两种不同的碱基。位于染色体上某一区域的一组相关联的位于染色体上某一区域的一组相关联的SNPSNP等位位点等位位点被称作单倍型被称作单倍型(haplotype)(haplotype),相邻,相邻SNPsSNPs的等位位点倾的等位位点倾向于以一个整体遗传给后代向于以一个整体遗传给后代.第6页
5、,共43页,编辑于2022年,星期五第7页,共43页,编辑于2022年,星期五根据SNP在基因组中的分布位置可分为:基因编码区SNP(cSNP)基因调控区SNP(pSNP)基因间随机编码区SNP(rSNP)等三类。因为编码区内的变异率占周围序列的1/5,cRNP的总量显著少于其他两类SNPs。第8页,共43页,编辑于2022年,星期五 cSNP又可分为2种:同义cSNP(synonymous cSNP):非同义cSNP(non-synonymous cSNP)第9页,共43页,编辑于2022年,星期五 同义同义cSNPcSNP:SNPSNP所导致的编码序列改变并不影响其所翻译所导致的编码序列改
6、变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列,突变碱基与未突变碱基的的蛋白质的氨基酸序列,突变碱基与未突变碱基的含义相同;含义相同;非同义非同义cSNPcSNP:指碱基序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋白指碱基序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变,从而影响蛋白质的功能。这种改质序列发生改变,从而影响蛋白质的功能。这种改变常常是导致生物性状改变的直接原因。变常常是导致生物性状改变的直接原因。位于基因调控区的位于基因调控区的SNPSNP则会影响基因表达量的多少,则会影响基因表达量的多少,因此,这两类因此,这两类SNPSNP在功能和疾病发生发展方面具有更在功能和疾病发生发展方面具有更重要的意义。
7、重要的意义。第10页,共43页,编辑于2022年,星期五SNPSNP的检测方法的检测方法 单链构象多态性单链构象多态性单链构象多态性单链构象多态性(single-strand conformational(single-strand conformational polymorphism,SSCP)polymorphism,SSCP)原理:单链DNA的折叠结构是由单核苷酸序列决定的,当某一个碱基发生突变时,便会直接影响该链的构象,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移率会发生改变。第11页,共43页,编辑于2022年,星期五SNP的检测方法的检测方法变性梯度凝胶电泳(变性梯度凝胶电泳(变性梯度凝胶电泳
8、(变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)electrophoresis,DGGE)原理原理:当双链当双链DNADNA在变性梯度凝胶中进行到与在变性梯度凝胶中进行到与DNADNA变性温变性温度一致的凝胶位置时,度一致的凝胶位置时,DNADNA发生部分解链,电泳迁移率发生部分解链,电泳迁移率下降,下降,DNADNA链中有一个碱基改变时,会在不同的时间发链中有一个碱基改变时,会在不同的时间发生解链,因影响电泳速度变化的程度而被分离。生解链,因影响电泳速度变化的程度而被分离。第12页,
9、共43页,编辑于2022年,星期五SNPSNP的检测方法的检测方法 TaqmanTaqmanTaqmanTaqman法法法法 以荧光共振能量传递以荧光共振能量传递(fluorescent resonance energy(fluorescent resonance energy transfer,FRET)transfer,FRET)为基础的检测方法。为基础的检测方法。在在PCRPCR反应中,将供者反应中,将供者-受者染料对分别结合到受者染料对分别结合到TaqmanTaqman探针的两端,探针的两端,探针未与目标序列结合时,通过探针未与目标序列结合时,通过FRETFRET作用使供者不发荧光;完
10、全作用使供者不发荧光;完全互补配对后,由于互补配对后,由于Taq DNATaq DNA聚合酶具有聚合酶具有5 5 核酸酶的活性,可将供者从核酸酶的活性,可将供者从探针上切下来从而发出荧光。如果探针与目标序列中存在错配碱基,就探针上切下来从而发出荧光。如果探针与目标序列中存在错配碱基,就会减少探针与目标序列结合的紧密程度及会减少探针与目标序列结合的紧密程度及Taq DNATaq DNA聚合酶切割供者的聚合酶切割供者的活性,也就影响了供者的荧光释放量,从而使碱基突变链和正活性,也就影响了供者的荧光释放量,从而使碱基突变链和正常链得以区分。常链得以区分。第13页,共43页,编辑于2022年,星期五
11、供者供者受者受者5 5 3 3 Taqman Taqman 探针探针探针探针第14页,共43页,编辑于2022年,星期五 供者供者受者受者5 5 3 3 Taqman Taqman 探针探针探针探针第15页,共43页,编辑于2022年,星期五 供者供者受者受者5 5 3 3 引物引物目标序列目标序列第16页,共43页,编辑于2022年,星期五受者受者5 5 3 3 引物引物 供者供者目标序列目标序列第17页,共43页,编辑于2022年,星期五SNPSNP的检测方法的检测方法 分子信标分子信标分子信标分子信标(molecular beacon)(molecular beacon)(molecul
12、ar beacon)(molecular beacon)法法法法 分子信标是一个分子信标是一个U U型的单链核苷酸探针(探针序列内部可有一型的单链核苷酸探针(探针序列内部可有一定程度的互补配对),在探针两端也加上供者定程度的互补配对),在探针两端也加上供者-受者染料对,受者染料对,U U型探型探针使两染料靠近,通过针使两染料靠近,通过FRETFRET作用使供者不发荧光。当探针与目标作用使供者不发荧光。当探针与目标序列完全互补配对后,两染料分离,使得供者的荧光亮增加,序列完全互补配对后,两染料分离,使得供者的荧光亮增加,如果如果目标序列中存在错配碱基,就会影响探针与其结合,从而影响到供者目标序列
13、中存在错配碱基,就会影响探针与其结合,从而影响到供者的荧光亮,使碱基突变链和正常链得以区分。的荧光亮,使碱基突变链和正常链得以区分。第18页,共43页,编辑于2022年,星期五供者供者受者受者第19页,共43页,编辑于2022年,星期五 供者供者受者受者第20页,共43页,编辑于2022年,星期五焦磷酸测序法 焦磷酸测序法焦磷酸测序法(pyrosequencing)(pyrosequencing)是一种不依赖平是一种不依赖平板胶或毛细管电泳,不依赖板胶或毛细管电泳,不依赖DNADNA的荧光标记的荧光标记/激发激发/检检测体系的序列分析技术,适用于已知序列的测体系的序列分析技术,适用于已知序列的
14、DNADNA片段进片段进行验证分析,适用于已知行验证分析,适用于已知SNPSNP的序列验证及基因分型。的序列验证及基因分型。第21页,共43页,编辑于2022年,星期五 焦磷酸测序法主要是由四种酶催化同一反应体系中的焦磷酸测序法主要是由四种酶催化同一反应体系中的酶级联反应酶级联反应:包括包括DNADNA聚合酶、硫酸化酶、萤光素酶和双磷酸酶聚合酶、硫酸化酶、萤光素酶和双磷酸酶;反应底物为反应底物为adenosine 5adenosine 5 phosphosulfate(APS)phosphosulfate(APS)和萤光和萤光素。素。反应体系还包括待测序的反应体系还包括待测序的DNADNA单链
15、和测序引物单链和测序引物。第22页,共43页,编辑于2022年,星期五 在每一轮测序反应中,加入一种在每一轮测序反应中,加入一种dNTPdNTP。如该如该dNTPdNTP与模板配对,聚合酶就可以催化该与模板配对,聚合酶就可以催化该dNTPdNTP掺入到引物链掺入到引物链中并释放焦磷酸基团中并释放焦磷酸基团(PPi)(PPi)。掺入的掺入的dNTPdNTP和释放的焦磷酸的物质的量相等,反应时和释放的焦磷酸的物质的量相等,反应时dATPdATP由由deoxyadenosine alfa-thio triphosphale(dATPaS)deoxyadenosine alfa-thio tripho
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