单核苷酸多态性及其应用 (2)精.ppt
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1、单核苷酸多态性及其应用第1 页,本讲稿共44 页SNP 的概念 单核苷酸多态性(单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP single nucleotide polymorphism,SNP)是指基因组是指基因组DNADNA序列中由于单个核苷酸的突变而引序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性。起的多态性。同一物种不同个体间染色体上遗传密码单个碱同一物种不同个体间染色体上遗传密码单个碱基的变化,主要表现为基因组核苷酸水平上的变异基的变化,主要表现为基因组核苷酸水平上的变异引起的引起的DNADNA序列多态性序列多态性。第2 页,本讲稿共44 页 Sin
2、gle nucleotide polymorphism第3 页,本讲稿共44 页 SNP的特征 SNP SNP是人类可遗传的变异中最常出现的一种,占所有 是人类可遗传的变异中最常出现的一种,占所有已知多态性的 已知多态性的90%90%以上,在人类基因组中广泛存在,人类 以上,在人类基因组中广泛存在,人类DNA DNA中每 中每300-1000bp 300-1000bp就有一个 就有一个SNP.SNP.因此,一个人类个体大约携带因此,一个人类个体大约携带300300万万-1000-1000万个万个SNPsSNPs。第4 页,本讲稿共44 页SNP的特征一个一个SNPSNP表示在基因组某个位点上一
3、个核苷酸的变化,表示在基因组某个位点上一个核苷酸的变化,作为一种碱基的替换,大多数为转换(作为一种碱基的替换,大多数为转换(CCT T,G GAA),),也可能是颠换。也可能是颠换。具有转换型变异的具有转换型变异的SNPSNP约占约占SNPSNP总量的总量的2233左右。左右。转换的发生率总是明显高于其它几种变异,而且在转换的发生率总是明显高于其它几种变异,而且在CGCG序列上出现最为频繁,多是发生序列上出现最为频繁,多是发生CC TT的转换,原因是的转换,原因是CGCG中的中的CC是甲基化的,它能自发的脱氨基而替换为胸腺嘧啶。是甲基化的,它能自发的脱氨基而替换为胸腺嘧啶。第5 页,本讲稿共4
4、4 页 SNP SNP大都表现为二等位基因(大都表现为二等位基因(bialletic)bialletic)多态多态性性,即在该位置只存在两种不同的碱基。即在该位置只存在两种不同的碱基。位于染色体上某一区域的一组相关联的位于染色体上某一区域的一组相关联的SNPSNP等位位等位位点被称作单倍型点被称作单倍型(haplotype)(haplotype),相邻,相邻SNPsSNPs的等位位点的等位位点倾向于以一个整体遗传给后代倾向于以一个整体遗传给后代.第6 页,本讲稿共44 页第7 页,本讲稿共44 页 根据SNP在基因组中的分布位置可分为:基因编码区SNP(cSNP)基因调控区SNP(pSNP)基
5、因间随机编码区SNP(rSNP)等三类。因为编码区内的变异率占周围序列的1/5,cRNP的总量显著少于其他两类SNPs。第8 页,本讲稿共44 页 cSNP又可分为2种:同义cSNP(synonymous cSNP):非同义cSNP(non-synonymous cSNP)第9 页,本讲稿共44 页同义同义cSNPcSNP:SNP SNP所导致的编码序列改变并不影响其所翻译所导致的编码序列改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列,突变碱基与未突变碱基的的蛋白质的氨基酸序列,突变碱基与未突变碱基的含义相同;含义相同;非同义非同义cSNPcSNP:指碱基序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋白质序指碱基
6、序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变,从而影响蛋白质的功能。这种改变常常是列发生改变,从而影响蛋白质的功能。这种改变常常是导致生物性状改变的直接原因。导致生物性状改变的直接原因。位于基因调控区的 位于基因调控区的SNP SNP则会影响基因表达量的多少,则会影响基因表达量的多少,因此,这两类 因此,这两类SNP SNP在功能和疾病发生发展方面具有更重要 在功能和疾病发生发展方面具有更重要的意义。的意义。第10 页,本讲稿共44 页SNP的检测方法 单链构象多态性单链构象多态性(single-strand conformational(single-strand conformatio
7、nal polymorphism,SSCP)polymorphism,SSCP)原理:单链DNA的折叠结构是由单核苷酸序列决定的,当某一个碱基发生突变时,便会直接影响该链的构象,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移率会发生改变。第11 页,本讲稿共44 页SNP 的检测方法变性梯度凝胶电泳(变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)electrophoresis,DGGE)原理原理:当双链当双链DNADNA在变性梯度凝胶中进行到与在变性梯度凝胶中进行到与DNADNA变性变性温度一致的凝胶
8、位置时,温度一致的凝胶位置时,DNADNA发生部分解链,电泳发生部分解链,电泳迁移率下降,迁移率下降,DNADNA链中有一个碱基改变时,会在不链中有一个碱基改变时,会在不同的时间发生解链,因影响电泳速度变化的程度而同的时间发生解链,因影响电泳速度变化的程度而被分离。被分离。第12 页,本讲稿共44 页SNP的检测方法 TaqmanTaqman法法 以荧光共振能量传递 以荧光共振能量传递(fluorescent resonance energy(fluorescent resonance energy transfer,FRET)transfer,FRET)为基础的检测方法。为基础的检测方法。在
9、 在PCR PCR反应中,将供者 反应中,将供者-受者染料对分别结合到 受者染料对分别结合到Taqman Taqman探针的 探针的两端,探针未与目标序列结合时,通过 两端,探针未与目标序列结合时,通过FRET FRET作用使供者不发荧光;作用使供者不发荧光;完全互补配对后,由于 完全互补配对后,由于Taq DNA Taq DNA聚合酶具有 聚合酶具有5 5 核酸酶的活性,可将 核酸酶的活性,可将供者从探针上切下来从而发出荧光。如果探针与目标序列中存在错配碱 供者从探针上切下来从而发出荧光。如果探针与目标序列中存在错配碱基,就会减少探针与目标序列结合的紧密程度及 基,就会减少探针与目标序列结合
10、的紧密程度及Taq DNA Taq DNA聚合酶切割供 聚合酶切割供者的活性,也就影响了供者的荧光释放量,从而使碱基突变链和正常链 者的活性,也就影响了供者的荧光释放量,从而使碱基突变链和正常链得以区分。得以区分。第13 页,本讲稿共44 页 供者受者5 3 Taqman 探针第14 页,本讲稿共44 页 供者受者5 3 Taqman 探针第15 页,本讲稿共44 页 供者受者5 3 引物目标序列第16 页,本讲稿共44 页受者5 3 引物 供者目标序列第17 页,本讲稿共44 页SNP的检测方法 分子信标分子信标(molecular beacon)(molecular beacon)法法 分
11、子信标是一个 分子信标是一个U U型的单链核苷酸探针(探针序列内部可有一 型的单链核苷酸探针(探针序列内部可有一定程度的互补配对),在探针两端也加上供者 定程度的互补配对),在探针两端也加上供者-受者染料对,受者染料对,U U型探 型探针使两染料靠近,通过 针使两染料靠近,通过FRET FRET作用使供者不发荧光。当探针与目标序 作用使供者不发荧光。当探针与目标序列完全互补配对后,两染料分离,使得供者的荧光亮增加,列完全互补配对后,两染料分离,使得供者的荧光亮增加,如果目 如果目标序列中存在错配碱基,就会影响探针与其结合,从而影响到供者的 标序列中存在错配碱基,就会影响探针与其结合,从而影响到
12、供者的荧光亮,使碱基突变链和正常链得以区分。荧光亮,使碱基突变链和正常链得以区分。第18 页,本讲稿共44 页供者受者第19 页,本讲稿共44 页 供者受者第20 页,本讲稿共44 页 焦磷酸测序法 焦磷酸测序法 焦磷酸测序法(pyrosequencing)(pyrosequencing)是一种不依赖平板胶 是一种不依赖平板胶或毛细管电泳,不依赖 或毛细管电泳,不依赖DNA DNA的荧光标记 的荧光标记/激发 激发/检测体系的 检测体系的序列分析技术,适用于已知序列的 序列分析技术,适用于已知序列的DNA DNA片段进行验证分析,片段进行验证分析,适用于已知 适用于已知SNP SNP的序列验证
13、及基因分型。的序列验证及基因分型。第21 页,本讲稿共44 页 焦磷酸测序法主要是由四种酶催化同一反应体系中焦磷酸测序法主要是由四种酶催化同一反应体系中的酶级联反应的酶级联反应:包括 包括DNA DNA聚合酶、硫酸化酶、萤光素酶和双磷酸酶 聚合酶、硫酸化酶、萤光素酶和双磷酸酶;反应底物为反应底物为adenosine 5adenosine 5phosphosulfate(APS)phosphosulfate(APS)和萤和萤光素。光素。反应体系还包括待测序的反应体系还包括待测序的DNADNA单链和测序引物单链和测序引物。第22 页,本讲稿共44 页 在每一轮测序反应中,加入一种 在每一轮测序反应
14、中,加入一种dNTP dNTP。如该 如该dNTP dNTP与模板配对,聚合酶就可以催化该 与模板配对,聚合酶就可以催化该dNTP dNTP掺入到引物链中 掺入到引物链中并释放焦磷酸基团 并释放焦磷酸基团(PPi)(PPi)。掺入的 掺入的dNTP dNTP和释放的焦磷酸的物质的量相等,反应时 和释放的焦磷酸的物质的量相等,反应时dATP dATP由 由deoxyadenosine alfa-thio triphosphale(dATPaS)deoxyadenosine alfa-thio triphosphale(dATPaS)替代 替代 因为 因为DNA DNA聚合酶对 聚合酶对dATPa
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- 单核苷酸多态性及其应用 2精 核苷酸 多态性 及其 应用
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