研究生课程-细胞培养与应用.pptx
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1、细胞培养与应用第 一 部分动物细胞培养技术定义:指将动物的某一组织取出,使其分散成单个细胞,在人工模拟体内生理 环境的条件下使之存活、生长和增殖动物细胞培养的技术。Bioengineer ing College Dalian University细胞培养与应用第 一 部分动物细胞培养技术定义:指将动物的某一组织取出,使其分散成单个细胞,在人工模拟体内生理 环境的条件下使之存活、生长和增殖动物细胞培养的技术。Bioengineer ing College Dalian University可分为原代培养和传代培养原代培养:又称初代培养。指将机体取出的 细胞或组织置于体外条件下生长,直到第一 次传
2、代之前的过程。大约能增殖10代左右。传代培养:也称继代培养。指细胞在培养器 皿中生长一定时间后,被分开接种到新的培 养器皿中继续培养。动物细胞培养Bioengineer ing College Dalian Universityv原代培养期v传代期v衰退期原代培养细胞的生命归宿Bioengineer ing College Dalian University1.贴壁型细胞(1)成纤维细胞型细胞(2)上皮细胞型细胞(3)游走型细胞(4)多形型细胞动物细胞体外培养的生长方式2.悬浮型细胞Bioengineer ing College Dalian University1.动物细胞的分裂周期长:动物
3、细胞分裂周期一般为12-48h。它不仅随细 胞种属的不同而有差异,即使是同一种属,不 同部位的细胞所需的时间也不同。此外,培养 条件如:温度、pH、培养基成分等也会影响分 裂周期的长短。动物细胞体外培养特点Bioengineer ing College Dalian UniversityBioengineer ing College Dalian University各类细胞分裂周期时间表2.贴附生长并伸展:贴附并伸展是贴壁型细胞体外培养时的基本 生长特点。它受许多因素影响,如离子浓度、机械、物理因素、生物因素等。动物细胞体外培养特点Bioengineer ing College Dalian
4、 University细胞贴壁后的伸展Bioengineer ing College Dalian University3.接触抑制(contact inhibitition)现象:贴壁生长的细胞分裂增殖,细胞间逐渐汇合 相互接触时,细胞停止增殖,即细胞密度不 再增加,这一现象称为接触抑制或密度依赖 抑制现象。动物细胞体外培养特点Bioengineer ing College Dalian University4.有限细胞系和永久细胞系原代培养细胞经继代培养后即成为有限细胞系 只能在有限的时间内生存,经过10-50代后细胞 逐渐死亡。细胞继代次数和存活时间的长短以 细胞来源的年龄和种属不同而有
5、差异。年龄越 大继代次数越少。动物细胞体外培养特点Bioengineer ing College Dalian University有限细胞系转化成永久细胞系称为“体外转化”。永久细胞系有如下特征:细胞变小,黏附性减少,具有较高的核质比;生 长速率增加,倍增时间缩短;对血清的依赖性减 小;贴壁依赖性降低;细胞异倍体和非整倍体增 加;细胞接种到体内后,生癌率上升。Bioengineer ing College Dalian University动物细胞与微生物和植物细胞相比,其培养难度要大一些,原因是动物细胞只有细胞膜,而没有 细胞壁的保护。因此对培养环境十分敏感,一切 影响细胞膜变形的因素都会
6、影响动物细胞存活。动物细胞体外培养特点Bioengineer ing College Dalian University5.动物细胞的环境敏感性1.温度:37 对低温耐受比对高温耐受强2.pH 7.2-7.4 对偏酸性耐受强些3.气体 O2和 CO2(5%)CO2+H2O H2CO3 H+HCO3-4.营养需求:培养基和血清5.渗透压6.无污染:培养要严格在无菌条件下进行,细菌、真菌、病毒、或其它细胞均可导致培养物的污染。动物细胞体外培养的条件Bioengineer ing College Dalian University实验室Bioengineer ing College Dalian U
7、niversity1.水处理设备:蒸馏水发生器、超纯水系统2.无菌设备:超净台、灭菌锅、滤器等 3.培养设备:CO2培养箱4.观察分析设备:显微镜、酶标仪等5.分离与保存设备:离心机、低温冰箱、液氮罐6.耗材:培养瓶,吸管,电动移液器,培养板,冻存管等常用实验用品、设备Bioengineer ing College Dalian University水处理设备Bioengineer ing College Dalian University自动双重纯水蒸馏器 纯水仪常用灭菌器具:v 超净工作台:为细胞操作提供无菌环境v 紫外灯:紫外线消毒v 压力蒸汽消毒器(灭菌锅):湿热消毒,用途广v 电热干
8、燥箱:干热消毒。v 滤器:过滤除菌无菌设备Bioengineer ing College Dalian Universityv超净工作台的工作原 理是利用鼓风机驱动 空气遁过高效滤器除 去空气中的尘埃颗粒,使空气得到净化。净 化空气徐徐通过工作 台面,使工作台内构 成无菌环境。超净工作台Bioengineer ing College Dalian University高压蒸汽灭菌锅湿热灭菌:121,20min 全过程约2h。Bioengineer ing College Dalian University电热干燥箱可用于器材烘干以及进行干热灭菌。干热灭菌(140,2-3h)烘干70 Bioen
9、gineer ing College Dalian University滤 器Bioengineer ing College Dalian UniversityBioengineer ing College Dalian Universityn设定条件为37,5CO2。n使用CO2培养箱时应注意的 问题:用螺旋口瓶培养细胞时,需 将瓶盖微松,以保证通气。保持培养箱内空气干净。定 期消毒(90,14 h)。蒸馏水槽中灭菌蒸馏水3000 毫升以保持箱内湿度,避免培 养液蒸发。CO2 培 养 箱Universi ty Bioenginee ring Colle ge Dali anBioengine
10、er ing College Dalian UniversityBioengineer ing College Dalian University酶标仪 微孔板震荡器Bioengineer ing College Dalian University酸度计天平培 养 瓶Bioengineer ing College Dalian University培 养 板Bioengineer ing College Dalian University冻 存 管Bioengineer ing College Dalian University刻度吸管和电动移液器Bioengineer ing College
11、 Dalian University动物细胞小规模培养方法有:培养瓶培养法、培养板培养法、培养皿培养法。准备工作:1.器材的清洗、包装和灭菌2.培养液及其他培养用液的配置实验室动物细胞培养的一般过程Bioengineer ing College Dalian University原代培养:组织块培养法用剪刀将组织剪成小块组织消化培养用酶液将组织小块进一步分散成细胞团或单个细胞传代培养细胞覆盖80%-90%是传代的最佳时期细胞培养Bioengineer ing College Dalian University组织块培养法Bioengineer ing College Dalian Univer
12、sityv取材分离v组织消化(胰蛋白酶、胶原酶)v培养过程组织消化培养Bioengineer ing College Dalian University传代培养Bioengineer ing College Dalian University动物细胞贴壁培养的生长阶段v 游离期v 贴壁期v 潜伏期v 对数生长期v 停止期(平台期)Bioengineer ing College Dalian University游离期:v细胞接种后在培养液中呈悬浮状态;也称悬浮期。此时细胞质回缩,胞体呈圆球形。v一般游离期持续10分钟4小时Bioengineer ing College Dalian Unive
13、rsity贴壁期:细胞附着于底物上,游离期结束。v贴壁表面要带阳性电荷和高度的表面活性;一般用 于细胞培养的表面是玻璃、塑料、金属和微载体。进口塑料培养瓶涂有生长基质(化学合成的功能基 团)。v血清中有促使细胞贴壁的带正电荷的糖蛋白(生长 基质),这些促贴壁因子先吸附于底物上,悬浮细 胞再附着于吸附的促贴壁因子。Bioengineer ing College Dalian University细胞贴壁过程Bioengineer ing College Dalian University潜伏期v此时细胞有生长活动,而无细胞分裂。v细胞株潜伏期一般为624小时。对数生长期:v细胞数随时间变化成倍增
14、长,活力最佳,最适合进行实验研究。停止期(平台期):v细胞长满瓶壁后,细胞虽有活力但不再分裂v机制:接触抑制、密度依赖性Bioengineer ing College Dalian UniversityBioengineer ing College Dalian University细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一。任何培养瓶内生长的细胞 都由死细胞和活细胞组成,从形态上区别死、培养细胞的活力测定活细胞是困难的。Bioengineer ing College Dalian UniversityBioengineer ing College Dalian University活
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