一株高效解磷真菌的筛选及其解磷机理研究.docx
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1、一株高效解磷真菌的筛选及其解磷机理研究 农业生产上迫切须要解决的问题。 土壤中含有多种微生物,可以使土壤中难溶性磷转化为可溶性磷,这些微生物被称作解磷菌或溶磷菌。此类微生物种类繁多,包括细菌、放线菌、真菌等12,尤其是真菌,其解磷效果是解磷细菌的几倍甚至更多,而且遗传性状更稳定4,近年来受到广泛关注。本探讨从耐贫瘠作物火龙果根际分别到一株解磷真菌,解磷效果良好,有望开发为解磷菌菌剂,增加土壤中有效磷含量,削减磷肥的施用量。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 土壤样品 植物根际是解磷菌在土壤中的主要存在部位5-6,故用于解磷真菌分别的土壤样品采自海南高校檐州校区农科试验基地火龙果园表层以
2、下510cm火龙果根际,取后放置在试验室晾干备用。 另外,取有效磷含量较低的土壤供试解磷真菌解磷效果验证,该土壤有效磷含量为4.13mg/kg,全磷含量为967.101mg/kg。 1.1.2 培育基 无机磷液体培育基4:葡萄-10g,2so40.5g,NaCl 0.3g,KCl 0.3g, MgSO4.7H2O0.3g,FeSO4.7H2O0.03g, MnSO4.7H2O0.03g,Ca325g,蒸馏水1010mL,调pH至7.07.5,分装,每瓶101ML,于121高压灭菌15min。 无机磷固体培育基:在无机磷液体培育基基础上加琼脂粉2%,于121高压灭菌15min。 解磷真菌固体发酵
3、培育基:玉米秸秆25g,麸皮25g,2SO40.5g,MgSO40.125g,KH2pO40.125g,加水50mL,装于1010ml,三角瓶中,121高压灭菌30min。 1.2 方法 1.2.1 解磷真菌的分别及初筛 将试验基地采回的土样晾干并研磨,过20目筛备用。称取10g研磨处理的土样于90mL的无菌水中,于28摇床中振荡培育30min,转速为150r/min。吸取1mL土壤悬浮液根据10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的梯度进行稀释,对最终3个稀释浓度各取200L涂布于加有101g/mL硫酸链霉素的无机磷固体培育基上,每个浓度3次重复,置于28的恒温箱中培育7。用无菌接种
4、针挑取具有较大透亮圈的单菌落转至PDA培育基上进行纯化,并于4冰箱保存备用。 用打孔器取解磷真菌菌落边缘菌块,接种在无机磷固体培育基中心,于28恒温培育箱中培育1周,测量菌落直径以及解磷圈直径,并计算比值D/d,通过该比值的大小对分别到的解磷真菌进行初筛。 1.2.2 解磷真菌的复筛 将初筛获得的解磷真菌接种于PDA培育基上,28培育培育7d后收集分生孢子,并利用血球计数板计数。将收集的分生孢子接种在101ml,无机磷液体培育基中,调整浓度至105个/mL,于28摇床中震荡培育,转速200r/min,7个重复。每天定时取样,每次取1瓶,测定发酵液pH,然后5000r/min离心10min后取上
5、清,用钼锑抗比色法测定可溶性磷的含量8。 1.2.3 解磷真菌的分子鉴定 解磷真菌活化后收集菌丝101mg,利用天根一植物基因组DNA提取试剂盒提取gDNA,以引物对ITS1和ITS4为引物9,扩增rDNA-ITS序列,回收后送生工测序,将测序结果在NCBI数据库中进行比对。 1.2.4 发酵液中有机酸种类的测定 将第6天发酵液离心后获得的上清经0.45m微孔滤膜过滤,利用高效液相色谱分析其中有机酸的种类及含量10。 1.2.5 解磷真菌对土壤解磷效果验证 参照1.2.2中方法收集解磷真菌分生孢子,并将收集的分生孢子接种在101ml, PD培育基中,调整分生孢子浓度至105个/mL,于28摇床
6、中振荡培育,制备种子液。24h后取5ml,种子液并加无菌水至50mL,加入固体发酵培育基中摇匀,于28培育。一周后,将真菌固体发酵产物按质量分数1%、5%、10%加入经高温灭菌的低有效磷土壤中混匀,装于养分钵中,每个养分钵400g,以不加菌土壤作为比照,每个处理3个重复。将养分钵放置于28,期间要保持土壤湿度。15d后将土壤自然风干,然后研磨过20目标准筛,利用钼锑抗比色法测定土壤中有效磷含量。 2 结果与分析 2.1 An-6具有较强的解磷效果 通过初筛,从火龙果根际土壤中分别纯化到一株具有解磷效果的真菌,命名为An-6。其菌落形态见图1-A,菌落中间黑色,边缘白色;光学显微镜视察菌丝为有隔
7、菌丝,分生孢子梗顶端球状,分生孢子椭圆形。该菌株在无机磷固体培育基上具有明显的解磷圈,解磷圈与菌落直径比值为1.38,表明该菌株具有较强的解磷实力。 将供试解磷真菌An-6接种在含有难溶性无机磷的液体培育基中,随着培育时间的延长,发酵液变得澄清,可溶性磷含量渐渐增加,且在048h内增速较快,在48h之后增速趋于平缓,当培育时间达到96h时,培育液中的可溶性磷含量达到最高值764.4mg/L,随后又有所下降,但降幅趨于稳定,可能是菌株起先苍老的结果,也可能是真菌将无机磷转化成为自身结构磷的结果。以上证明该真菌具有溶解难溶性磷的实力。 2.2 An-6解磷解磷机理初探 通过定时测定上述发酵液pH,
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- 高效 真菌 筛选 及其 机理 研究
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